大鼠肝移植免疫耐受的蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究.pdf

1、器官移植是眾多終末期器官功能衰竭患者的唯一選擇。雖然高效免疫抑制劑的應(yīng)用明顯提高了肝移植患者的生存率，但急性排斥反應(yīng)（Acute Rejection，AR）仍然是肝移植術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率仍然高達(dá)40％-60％，因此免疫耐受仍然是肝移植研究的重點(diǎn)之一。新興的蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)基因組所編碼的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的學(xué)科。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)使我們對(duì)肝移植免疫耐受的發(fā)生、發(fā)展有了更詳盡的理解。
　　 一、大鼠原位肝移植模型的建立

2、>　　 為了觀察兩種不同品系即近交系Wistar和封閉群SD大鼠原位肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)及F蛋白誘導(dǎo)肝移植免疫耐受的情況。我們將健康雄性清潔的近交系Wistar和封閉群SD大鼠隨機(jī)分為3組，A：同基因?qū)φ战M：SD→SD；B：急性排斥組：Wistar→SD；C：F蛋白干預(yù)組：術(shù)前一周胸腺內(nèi)注射0.4mg。采用Kamada二袖套法，建立上述Wistar和SD組合之間的肝移植模型。A、B和C組受體分別于術(shù)后3d、6d、9d及100d，四

3、個(gè)時(shí)間點(diǎn)各殺死三只大鼠，收集肝組織和血清分別做相應(yīng)檢測(cè)，另留取部分新鮮肝組織立即置入液氮中保存?zhèn)溆?。剩余的大鼠用于觀察肝移植術(shù)后長(zhǎng)期生存率。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共完成108例次大鼠原位肝移植（ratorthotopic liver transplantation，ROLT）操作，總的手術(shù)成功率為62.96％（68/108），其中模型訓(xùn)練的前期完成45例，24h成活率僅24.44％（11/45）以后隨著手術(shù)技巧成熟，手術(shù)成功率逐漸達(dá)到90％以上。大

4、鼠肝移植手術(shù)死亡的主要原因?yàn)槌鲅?、麻醉意外、無(wú)肝期太長(zhǎng)、血栓形成等。A組同基因?qū)φ战M，術(shù)后組織學(xué)檢查無(wú)排斤反應(yīng)表現(xiàn)。B組急性排斥組自術(shù)后3d開始，出現(xiàn)Ⅰ級(jí)排斥反應(yīng)，6d以后逐漸達(dá)到高峰，大多數(shù)死于術(shù)后12～21d。C組F蛋白干預(yù)組亦未見(jiàn)確切排斥反應(yīng)證據(jù)。結(jié)果表明：（1）二袖套法操作簡(jiǎn)便，手術(shù)成功率高，可作為肝移植實(shí)驗(yàn)的有效手段。（2）成功建立大鼠原位肝移植模型的關(guān)鍵在于完善的手術(shù)技術(shù)，主要包括高質(zhì)量的供肝獲取、熟練的顯微血管吻合技術(shù)和盡

5、量短的無(wú)肝期。（3）近交系Wistar和封閉群SD大鼠之間建立的原位肝移植模型，能滿足急性排斥反應(yīng)或免疫耐受實(shí)驗(yàn)研究的需要。（4）F蛋白可以誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受。
　　 二、大鼠肝移植免疫耐受的蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究
　　 應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（nanoUPLC-MS/MS）研究大鼠原位肝移植術(shù)后7天免疫耐受組和同基因?qū)φ战M差異表達(dá)蛋白質(zhì)的情況，對(duì)大鼠原位肝移植后的免疫耐受情況進(jìn)行初步研究。建立免疫耐受組（Wist

6、ar→SD+F蛋白）n=5，建立同基因?qū)φ战M（SD→SD）n=5。分別于術(shù)后7天處死5只受體，取肝組織，提取總蛋白，Trypsin酶解后，使用Waters公司獨(dú)家專利MSe無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)，通過(guò)利用nanoUPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定蛋白質(zhì)，生物信息學(xué)工具對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類。結(jié)果顯示免疫耐受組和同基因?qū)φ战M相比，兩樣品中同時(shí)存在的大部分蛋白上調(diào)，其中9個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平明顯上調(diào)，比值變化在2.59