Wnt3a蛋白體外誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一類存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞,它具有自我更新、分化增殖和多向分化潛能等特點(diǎn),在特定誘導(dǎo)條件下可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌原細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等,還可向神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞等分化。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)許多物種的胚胎發(fā)育、器官形成、腫瘤形成和干細(xì)胞分化具有重要作用。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路(canonical Wnt Signal Pathway)和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路

2、(noncanonical Wnt Signal Pathway)。對(duì)于經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的作用,目前存在兩種相反的觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)認(rèn)為:經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)心肌分化起抑制作用;另一種觀點(diǎn)認(rèn)為:經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)心肌分化起促進(jìn)作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外源性加入Wnt3a蛋白及經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑Dickkopf1(Dkkl),研究體外誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs),向心肌樣細(xì)胞分化的作用及其可能機(jī)

3、制,為探討經(jīng)典Wnt信號(hào)通路對(duì)于干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 方法:
　　 1、取成年小鼠股骨及脛骨,分離mMSCs進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增,免疫組化染色予以鑒定;取小鼠乳鼠(＜3d)心臟,分離心肌細(xì)胞并培養(yǎng)。
　　 2、在mMSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加不同濃度Wnt3a蛋白(50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml),于干預(yù)第4天提取蛋白,Western blot方法檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)

4、通路蛋白β-連鎖蛋白(β-catenin)的表達(dá)情況。
　　 3、于不同時(shí)間段(0、1、2、4、6、12天)在mMSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加Wnt3a蛋白及經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑Dkkl蛋白,于第12天提取總mRNA或蛋白,RT-PCR方法檢測(cè)心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(Nkx2.5,GATA4)和α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)的核酸表達(dá),Western blot方法檢測(cè)心肌肌鈣蛋白-Ⅰ(cTnI)蛋白表達(dá)情況。
　　 4、在mM

5、SCs基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加Wnt3a蛋白及PI3/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002,Western blot方法檢測(cè)心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(Nkx2.5,GATA4)蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定,并繪制生長(zhǎng)曲線
　　 1.1 mMSCs常規(guī)培養(yǎng)第3天可見(jiàn)由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的集落,10天左右時(shí)可見(jiàn)集落中的細(xì)胞大量增殖并呈“旋渦狀”生長(zhǎng):免疫組化染色可見(jiàn),幾乎所有細(xì)胞表面表達(dá)CD29、

6、CD44陽(yáng)性,不表達(dá)CD45;由生長(zhǎng)曲線可見(jiàn),mMSCs在48h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,第5天后進(jìn)入平臺(tái)期。
　　 1.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)3-4h后逐漸貼壁,24h后細(xì)胞貼壁變多角形或梭形,個(gè)別細(xì)胞可見(jiàn)自發(fā)性搏動(dòng),搏動(dòng)頻率約40～120次/分;培養(yǎng)72h后,細(xì)胞充分鋪展,貼壁牢固。
　　 2.Wnt3a蛋白對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的激活:Western blot結(jié)果顯示,基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入濃度為100ng/ml的Wnt3a蛋白時(shí),經(jīng)典Wn

7、t通路蛋白β-catenin激活增加。
　　 3.Wnt3a蛋白的促分化作用:RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示,隨著Wnt3a蛋白干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),Nkx2.5、GATA4、α-MHC及cTnI表達(dá)呈現(xiàn)先增高后降低趨勢(shì);其中,僅前2天加入Wnt3a蛋白時(shí),上述各指標(biāo)增高最明顯。
　　 4.PI3K/Akt信號(hào)通路在Wnt3a蛋白促mMSCs分化中的作用:Western blot結(jié)果顯示,Wnt3a蛋白干預(yù)mM

8、SCs早期P-Akt表達(dá)增加,以30min和1h時(shí)最明顯;加入PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002后,這種趨勢(shì)被阻斷,且Nkx2.5、GATA4表達(dá)明顯減少。
　　 結(jié)論:
　　 1.Wnt3a蛋白通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)mMSCs～心肌樣細(xì)胞分化。
　　 2.Wnt3a蛋白對(duì)于mMSCsN心肌樣細(xì)胞分化存在階段特異性的雙向調(diào)節(jié)作用,即僅早期(＜4d)干預(yù)促進(jìn)分化,持續(xù)干預(yù)至更長(zhǎng)時(shí)間則無(wú)促分化作用。作