siRNA沉默HIF-1α在缺氧狀態(tài)下對鼻咽癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、鼻咽癌在頭頸部惡性腫瘤中的發(fā)病率居首位，而廣東省是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)。放射治療作為目前對鼻咽癌最有效的治療手段，但放射線的無選擇性對機體正常組織造成較大的毒副作用、且產(chǎn)生諸多的臨床并發(fā)癥以及放療后復(fù)發(fā)；要求提出更好的治療手段來解除病人的痛苦。作為生長迅速的實體腫瘤，鼻咽癌生長到一定體積時，癌細(xì)胞常常處于缺氧微環(huán)境，為了維持腫瘤持續(xù)生長，必須依賴新生血管形成（angiogenesis），因此，腫瘤細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)和血管生成是腫瘤發(fā)展過程中的關(guān)

2、鍵步驟，且與腫瘤的生長和擴散密切相關(guān)。在此過程中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）起到中樞紐帶作用；HIF-1α是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，其在許多腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤高度侵襲性、易轉(zhuǎn)移、對放化療不敏感和預(yù)后不良密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，對血管形成具有重要作用；同時，VEGF的活性亦受到多種因素的調(diào)控；近年來的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在缺氧組織中的轉(zhuǎn)錄活化主要受缺氧誘導(dǎo)因子-1調(diào)節(jié)，并

3、保持其mRNA的穩(wěn)定性。RNA干擾是近年來研究基因功能的一個強有力的武器，隨著RNA干擾技術(shù)在哺乳動物應(yīng)用研究的深入，利用RNA干擾技術(shù)開展基因治療為腫瘤的治療提供了新的途徑。本研究以鼻咽癌細(xì)胞系CNE-Ⅱ為研究對象，通過體外模擬缺氧微環(huán)境，以RNA干擾為手段，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，研究HIF-1α小片段干擾性RNA（siRNA）對缺氧誘導(dǎo)的CNE-Ⅱ細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后低氧條件下HIF-1α和VEGF的表達(dá)，初步探討HIF-1α在缺氧條件

4、下對鼻咽癌血管生成的調(diào)控作用。 目的：本研究以鼻咽癌細(xì)胞系CNE-Ⅱ為研究對象，通過體外模擬缺氧微環(huán)境，以RNA干擾為手段，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，研究HIF-1α小片段干擾性RNA（siRNA）對缺氧誘導(dǎo)的CNE-Ⅱ細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后低氧條件下HIF-1α和VEGF的表達(dá)，初步探討HIF-1α在缺氧條件下對鼻咽癌血管生成的調(diào)控作用。 方法： 1.HIF-1α siRNA制備：設(shè)計并合成siRNA（siRNA+陰性對

5、照），并在GenBank database進(jìn)行BLAST檢索作同源性分析。 2.CNE-Ⅱ細(xì)胞的培養(yǎng):CNE-Ⅱ細(xì)胞采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞至37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗。在培養(yǎng)基中加入濃度為100μmol/L的CoCl2用于模擬腫瘤內(nèi)部乏氧微環(huán)境。 3.轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞：利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將合成的HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)入

6、鼻咽癌細(xì)胞CNE-Ⅱ內(nèi)。 4.因素檢測 （1）樣品處理：TRIZOL試劑盒提取細(xì)胞的總RNA；RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。 （2）RT-PCR：總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取其cDNA，根據(jù)文獻(xiàn)報道合成特異性引物，以半定量PCR克隆檢測CNE-Ⅱ中HIF-1α及VEGF在RNA水平上的表達(dá)情況。 （3）Western blot：蛋白樣品的制備，蛋白的定量，SDS-PAG電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光、顯影、定

7、影。 結(jié)果： 1.常氧條件下，CNE-Ⅱ細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)水平穩(wěn)定，VEGFmRNA表達(dá)下調(diào)，HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。 2.低氧條件下，CNE-Ⅱ細(xì)胞HIF～1α mRNA表達(dá)水平穩(wěn)定，蛋白表達(dá)顯著升高，而VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高。 3.siRNA轉(zhuǎn)染CNE-Ⅱ后能夠顯著下調(diào)HIF-1α的基因表達(dá)，同時VEGF基因的表達(dá)也受到明顯抑制。 結(jié)論：