重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡的構(gòu)建及免疫效能研究.pdf

1、登革病毒(Dengue virus, DV)為有包膜的單正鏈RNA病毒,黃病毒屬成員,以埃及伊蚊和白蚊伊蚊為媒介廣泛流行于熱帶和亞熱帶國(guó)家和地區(qū)。引起人類(lèi)感染的登革病毒共有4種血清型,其所致的登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。全球有25~30億人生活在登革熱流行區(qū)內(nèi),每年有1億以上的人遭受感染,其中約100萬(wàn)人會(huì)發(fā)展成更為嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合癥,死亡率5~20％。我國(guó)東南沿海是登革熱的重點(diǎn)流行區(qū)域,每

2、年都有爆發(fā)流行,且隨著全球人口流動(dòng)及蚊媒遷徙,登革熱將越來(lái)越成為我國(guó)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前對(duì)登革熱尚未有效的防治措施,疫苗是預(yù)防和控制登革熱的有效手段,以往的登革熱疫苗研究主要集中在單一血清型別,效果單一;或?qū)?種型別DV的某一肽段串聯(lián)在一起,分子量大,結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不完整,效果不佳;尤其是 DV存在抗體依賴(lài)的感染增強(qiáng)現(xiàn)象(Antibody-dependent enhancement, ADE),即感染一種血清型DV后,機(jī)體產(chǎn)生的抗體(主要是非

3、中和抗體)在另一血清型DV感染時(shí)可導(dǎo)致感染增強(qiáng),引起嚴(yán)重的出血熱,故迄今尚無(wú)安全、可靠的登革疫苗上市。
　　課題組前期對(duì)4種型別DV的抗原進(jìn)行了表位分析,以DV抗原分子之中和表位集中的包膜 E蛋白 III區(qū)為基礎(chǔ),采用氨基酸簡(jiǎn)并機(jī)制,設(shè)計(jì)、篩選并制備了一組抗原分子,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明能刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度(1:204800)的保護(hù)性抗體,動(dòng)物保護(hù)率>95%。在此基礎(chǔ)上獲得了一條具有交叉保護(hù)功能的候選疫苗分子(DV-EDIII),經(jīng)初步細(xì)胞

4、和動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明 DV-EDIII對(duì)不同血清型登革病毒感染有交叉保護(hù)作用,減少了 ADE發(fā)生(已申報(bào)發(fā)明專(zhuān)利201110300602.3),但如何選擇合適的疫苗載體來(lái)呈遞DV-EDIII是接下來(lái)需要思考的問(wèn)題。
　　細(xì)菌膜泡(membrane vesicles, MVs)是以出芽方式從細(xì)菌表面分泌的球形雙層膜結(jié)構(gòu),直徑20-200nm不等,是細(xì)菌分泌胞外因子的重要機(jī)制之一。作為新的疫苗遞送系統(tǒng),不僅能將有效抗原表位呈現(xiàn)在膜泡表面

5、,模擬天然病毒誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫,同時(shí)膜泡為細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中自然分泌,具有穩(wěn)定,高效等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái),革蘭陰性菌的膜泡作為新的疫苗傳遞載體在預(yù)防腦膜炎、細(xì)菌性痢疾、肺結(jié)核等流行性疾病方面得到廣泛關(guān)注,腦膜炎奈瑟菌膜泡疫苗的應(yīng)用更證實(shí)了細(xì)菌膜泡作為疫苗載體使用的前景,雖然膜泡誘發(fā)的機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制尚未了解清楚,但這種免疫保護(hù)與膜泡攜帶傳遞的一種或多種抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫力有關(guān)。2009年Lee等人證實(shí)革蘭陽(yáng)性菌也能產(chǎn)生細(xì)菌膜泡,如果能使

6、用革蘭陽(yáng)性菌膜泡作為疫苗組分的遞送系統(tǒng),既可避免革蘭陰性菌熱原質(zhì)LPS的影響,也可將外源基因插入膜泡攜帶主要抗原基因中,形成融合蛋白并隨膜泡分泌,從而達(dá)到制備多種疫苗乃至多價(jià)疫苗的目的。本課題利用新近發(fā)現(xiàn)的革蘭陽(yáng)性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的膜泡分泌機(jī)制,通過(guò)基因重組技術(shù)將課題組前期設(shè)計(jì)合成的登革病毒保護(hù)性抗原分子 DV-EDIII插入到金黃色葡萄球菌膜泡攜帶蛋白中,通過(guò)金黃色葡萄球菌的膜泡分泌,制備登

7、革熱膜泡疫苗,并對(duì)其免疫效能進(jìn)行研究,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.金黃色葡萄球菌膜泡的制備及DV-EDIII融合靶蛋白分子的篩選
　　常規(guī)培養(yǎng)金黃色葡萄球菌 RN4220,對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾,使體積縮小至原體積的1/6,然后超高速離心獲得細(xì)菌膜泡的粗純產(chǎn)物,然后通過(guò)密度梯度離心法對(duì)膜泡作進(jìn)一步純化,獲得細(xì)菌膜泡。透射電鏡觀察,證實(shí)所制備的膜泡直徑為20-200nm,圓形或橢圓形,膜泡結(jié)構(gòu)。通過(guò)SDS-PAGE對(duì)制備的膜

8、泡進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌膜泡攜帶有多種蛋白成分,選取其中豐度較高的條帶(5條),切膠進(jìn)行質(zhì)譜分析,篩選出膜泡攜帶的金黃色葡萄球菌編碼的丙酮酸脫氫酶β亞單位(PdhB,分子量37kDa)作為登革病毒EDIII抗原插入的靶蛋白分子。
　　2.重組登革病毒EDIII膜泡產(chǎn)生工程菌的構(gòu)建
　?、俳瘘S色葡萄球菌 RN4220-EDIII+工程菌的構(gòu)建:為將登革病毒具有保護(hù)功能的簡(jiǎn)并序列DV-EDIII插入金黃色葡萄球菌PdhB的

9、羧基端,使之與PdhB形成融合蛋白并隨細(xì)菌膜泡分泌。本課題利用同源重組原理,以金黃色葡萄球菌RN4220基因組中pdhB基因的鄰近序列為靶標(biāo),設(shè)計(jì)同源重組左、右臂,利用 PCR擴(kuò)增獲得左、右同源臂,再用 PCR從 pSET16質(zhì)粒中擴(kuò)增含氯霉素抗性基因的片段,從 pET22b-EDIII質(zhì)粒中擴(kuò)增DV-EDIII簡(jiǎn)并序列。運(yùn)用重疊延伸PCR方法,獲得“同源左臂-EDIII-氯霉素抗性基因-同源右臂”全長(zhǎng)敲入片段,插入大腸埃希菌-金黃色葡

10、萄球菌穿梭質(zhì)粒pYT3,構(gòu)建同源敲入質(zhì)粒pYT3-EDIII。應(yīng)用電轉(zhuǎn)化方法將pYT3-EDIII轉(zhuǎn)化金黃色葡萄球菌RN4220感受態(tài),并根據(jù)pYT3質(zhì)粒的溫敏特性,篩選具有氯霉素抗性的克隆,提取基因組,采用PCR和核酸測(cè)序鑒定均表明登革病毒簡(jiǎn)并EDIII序列與金黃色葡萄球菌的pdhB基因融合正確。Western blot鑒定顯示EDIII-PdhB融合蛋白不僅可以在細(xì)菌菌體中正確表達(dá),并可通過(guò)膜泡分泌機(jī)制釋放到胞外,將這種能分泌含 D

11、V-EDIII膜泡的重組金黃色葡萄球菌命名為RN4220-EDIII+。
　?、赗N4220-Δagr/EDIII+工程菌的構(gòu)建:在獲得 RN4220-EDIII+工程菌后,利用該菌制備了細(xì)菌膜泡,在動(dòng)物免疫過(guò)程中發(fā)現(xiàn)注射50μg/只的小鼠會(huì)死亡,表明膜泡有較強(qiáng)的毒力。為降低重組登革熱膜泡的毒力,提高膜泡使用的安全性,我們?cè)O(shè)計(jì)并敲除了 RN4220-EDIII+工程菌中調(diào)控細(xì)菌毒力的附屬調(diào)節(jié)基因agr,并觀察了agr敲除后工程菌產(chǎn)

12、生膜泡的毒力變化。首先以構(gòu)建的RN4220-EDIII+工程菌基因組為模板,用PCR分別擴(kuò)增其agr基因的上、下游約900bp片段,將上下游片段直接連接(中間不含agr編碼基因)后插入穿梭質(zhì)粒pYT3,構(gòu)建敲除載體pYT3::Δagr,電轉(zhuǎn)化RN4220-EDIII+,利用pYT3的溫敏特性,篩選對(duì)四環(huán)素敏感的菌株,提取基因組, PCR驗(yàn)證獲得 agr基因成功敲除的菌株,命名為RN4220-Δagr/EDIII+。制備RN4220-Δa

13、gr/EDIII+菌株的膜泡,按50μg/只劑量進(jìn)行小鼠攻毒實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示工程菌agr基因缺失后,膜泡的毒力大大降低,為后續(xù)制備安全穩(wěn)定的登革熱膜泡疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　3.重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡的免疫效能研究
　?、倌づ莸闹苽?利用發(fā)酵罐培養(yǎng) RN4220-Δagr/EDIII+工程菌,分離培養(yǎng)上清制備細(xì)菌膜泡,經(jīng) BCA法測(cè)定膜泡的蛋白總量,結(jié)果顯示利用發(fā)酵罐制備的重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡產(chǎn)量約為23mg/

14、L。
　?、谀づ菝庖哐逯苽?采用腹腔、肌肉、皮下多點(diǎn)注射免疫6~8周齡Balb/c小鼠(50μg/只),免疫三次后采血,制備免疫血清,ELISA法測(cè)定血清的抗體效價(jià)。
　?、勰づ菝庖哐宓拿庖弑Ｗo(hù)性:通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和病毒噬斑形成抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膜泡免疫血清對(duì)vero細(xì)胞的攻毒保護(hù)作用,結(jié)果顯示膜泡免疫血清在1:20~1:40時(shí)能夠完全阻斷登革病毒對(duì)vero細(xì)胞的感染,隨著抗體稀釋度升高,對(duì) DV-2的中和能力下降,但在抗

15、體稀釋度為1:320時(shí),仍能保護(hù)約60%的細(xì)胞免受DV-2的感染,表明重組登革病毒EDIII細(xì)菌膜泡免疫血清具有較好的保護(hù)效果。
　　綜上所述,本文通過(guò)基因重組敲入技術(shù)將課題組前期設(shè)計(jì)、合成的對(duì)登革病毒具有保護(hù)能力的抗原表位 DV-EDIII簡(jiǎn)并序列成功融合入金黃色葡萄球菌 pdhB的3’-端終止密碼前,并可隨膜泡的分泌機(jī)制進(jìn)行分泌表達(dá);通過(guò)敲除登革熱膜泡產(chǎn)生工程菌的毒力調(diào)控基因 agr,降低了膜泡的毒力,提高了重組膜泡的安全性。