堿性成纖維細胞生長因子在活性全層皮膚構建中的作用.pdf

1、目的：
　　人工培養(yǎng)皮膚于20世紀80年代開發(fā)成功，開皮膚再生醫(yī)學的先河。然而，人工培養(yǎng)皮膚在形態(tài)和功能上與正常皮膚有較大的差距，因此培養(yǎng)皮膚質量的不斷改良是研究者們不懈努力的目標，更是臨床應用的迫切需要。bFGF又稱為FGF2，影響細胞的增殖、遷移和分化。bFGF不僅刺激成纖維細胞增殖和膠原蛋白的分泌，對血管新生也有強烈的促進作用?；蛑亟MbFGF在臨床上已經(jīng)有了較長時間的應用，對培養(yǎng)皮膚的構成細胞—成纖維細胞以及表皮角化細胞都

2、有直接或間接的影響。在活性全層皮膚的培養(yǎng)過程中添加bFGF，對培養(yǎng)皮膚進行組織形態(tài)學以及細胞狀態(tài)研究。我們期待bFGF的添加能夠改善培養(yǎng)皮膚的質量，同時以該培養(yǎng)皮膚為模型，探討bFGF在皮膚創(chuàng)傷修復中的作用。
　　方法：
　　從手術時廢棄的剩余正常皮膚分離出表皮角化細胞和成纖維細胞并體外培養(yǎng)擴增。采用第4代表皮角化細胞構建全層活性皮膚（living skin equivalent, LSE），第5代真皮成纖維細胞構建活性全層

3、皮膚(LSE)。準備I型牛膠原溶液（Sigma公司，美國)6容量，0.1N NaOH1容量，8倍濃度DMEM1容量，20％FCS/DMEM10容量，將上述溶液在4℃進行混合。每個insert(Transwel-COL, membrane pore size,3μm, Costar;Corning公司，美國)中添加1ml，于室溫靜置10分鐘，使其膠凍化。在10%FCS/DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)制成纖維細胞為5x105個/ml。將該細胞懸液2容

4、量與上述膠原混合液8容量進行混合，每個insert緩慢注入3.5ml后待其膠凍化，而后添加10%FCS/DMEM培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中靜置。5日后，在收縮凹陷的膠原凝膠上播種表皮角化細胞，液相下培養(yǎng)2日待細胞達到融合后，開始氣液面培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中添加30ng/ml bFGF（珠海億勝生物制藥有限公司，中國），對照組添加等劑量的無菌注射用水，每2日換液一次。在氣液面培養(yǎng)后的不同時點（2周、3周、4周）采取LSE樣本，進行石蠟包埋。制作6μ

5、m厚石蠟切片，進行Hematoxylin-eosin(HE)染色和免疫組織化學染色。圖像由奧林帕斯 AX80顯微鏡耦合奧林帕斯 DP50數(shù)碼相機(Olympus公司，日本)拍攝獲取。采用image-pro plus6.0(ipp)圖像分析軟件分別測量實驗組與對照組的真皮層厚度，統(tǒng)計結果以均數(shù)±標準誤（χ±S(χ)）的形式表示，各周的兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗，P值<0.05，P值<0.01為有顯著性差異。
　　結果：
　　一

6、、組織學所見
　　HE染色結果顯示，氣液面培養(yǎng)2周時，bFGF添加組和未添加組的真皮厚度可見明顯差異。3周、4周，bFGF添加組仍保留了較厚的真皮成分。
　　二、免疫組化染色
　　1.分化型keratin的表現(xiàn)
　　bFGF非添加組2周、3周，Keratin1在表皮上層表達，但是第4周幾乎全部消失；bFGF添加組2周、3周，Keratin1也在表皮上層表達，但是與bFGF非添加組相比，Keratin1的表現(xiàn)更接近

7、正常皮膚的表現(xiàn)并持續(xù)到4周。Keratin10在bFGF非添加組幾乎沒有表達；而在bFGF添加組2周、3周、4周，Keratin10主要以棘層為中心表達。
　　2.增殖型keratin的表現(xiàn)
　　作為增殖型keratin的keratin6和keratin16的染色有基本相同的表現(xiàn)形式。在bFGF未添加組2周、3周、4周，keratin6和keratin16從基底層到棘層有非常強的表現(xiàn)，其中3周的表現(xiàn)最強；與未添加組相比，bF

8、GF添加組的keratin6和keratin16全時點的表達明顯受到抑制。
　　3.α-SMA的表現(xiàn)
　　α-SMA作為肌成纖維細胞的標記物，在增生性瘢痕中有較強的表現(xiàn)。在bFGF未添加組，2周于表皮和真皮交界處可見α-SMA陽性細胞，3周表現(xiàn)增強，一直持續(xù)到第4周；而在bFGF添加組，2周、3周、4周都僅有極少量的α-SMA陽性細胞。與bFGF未添加組相比，bFGF添加組α-SMA的表達被顯著抑制。
　　三、真皮厚度

9、的測量
　　氣液面培養(yǎng)，表皮重層化開始后2周、3周、4周分別測量bFGF添加組和未添加組的真皮厚度，bFGF添加組的真皮厚度明顯厚于未添加組，t檢驗結果顯示各時間點的兩組間比較均有統(tǒng)計學差異（*P<0.05,**P<0.01）。
　　結論：
　　構建活性全層皮膚時，在培養(yǎng)基中加入 bFGF，抑制了真皮成分的菲薄化，使表皮的增殖和分化狀態(tài)更接近正常皮膚，并且bFGF的添加抑制了肌成纖維細胞的形成，提示對瘢痕的形成有抑制作