兔骨髓間充質干細胞分化為角膜上皮樣細胞的體外研究.pdf

1、目的： 角膜上皮層是覆蓋角膜表面的復層上皮組織，對于維持眼表的健康和穩(wěn)定具有重要作用。正常狀態(tài)下，角膜上皮細胞可以不斷的脫落、更新；外界因素引起的角膜上皮損傷也可很快修復。角膜上皮層的自我修復有賴于角膜緣基底層的成體干細胞——角膜緣干細胞(Limbal stem cells，LSCs)。 當角膜緣受損，引起角膜緣干細胞缺乏或功能缺陷(Limbal stem cells deficiency，LSCD)時，會發(fā)生持續(xù)性角膜

2、上皮糜爛，角膜結膜上皮化，新生血管長入和假性翼狀胬肉形成等一系列病理改變，給患者帶來巨大的痛苦，甚至最終導致失明。隨著對LSCs研究的深入和發(fā)展，相繼出現了一系列針對上述疾病的治療方法，包括：羊膜移植、自體角膜緣移植、異體角膜緣移植及培養(yǎng)LSCs移植等。但是對于嚴重的LSCD，特別是雙眼LSCD，目前還沒有十分有效的治療方法，因此探討應用其他干細胞系重建LSCs缺乏性眼表是目前亟待解決的問題。 骨髓間充質干細胞(Mesenchy

3、mal stem cells，MSCs)是來源于胚胎發(fā)育早期中胚層的一類多能干細胞，主要存在于骨髓，由于其高度的自我更新能力和多向分化潛能而受到廣泛的關注。大量文獻研究表明在適當條件下，MSCs不但可分化成骨、軟骨、脂肪和肌肌肉等中胚層組織，還可以分化成腦、皮膚、視網膜等其他胚層的組織。這種跨系分化被稱為轉分化。研究證明MSCs可以分化為皮膚，肺及其他組織的上皮細胞，而近期研究發(fā)現將體外培養(yǎng)的人MSCs移植到損傷的兔或鼠角膜表面，可以重

4、建損傷眼表，其治療作用主要與抑制炎癥反應和新生血管有關。這些研究結果提示MSCs在角膜組織損傷修復中具有潛在的重大應用價值。 為檢測MSCs是否可以分化為角膜上皮細胞，我們用含有兔MSCs的膠原膜重建兔損傷眼表，結果顯示移植的兔MSCs到達角膜上皮基底層，并表達角膜上皮細胞的表面標記抗原細胞角蛋白3(cytokeratin3)(已投稿)，說明MSCs具有向角膜上皮細胞分化的可能。 但目前關于MSCs向角膜上皮細胞誘導分化

5、的研究還十分有限；并且由于細胞融合現象的發(fā)現，人們對于MSCs多向分化的可塑性存在一定爭議。因此進一步研究MSCs向角膜上皮細胞分化的可行性，及這一過程中可能的參與因素具有重要意義。 為此本研究利用不同體外環(huán)境誘導培養(yǎng)MSCs，初步證明MSCs可以在體外誘導分化為角膜上皮樣細胞，并且在這一分化過程中表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)具有重要作用。本研究首次證明在體外誘導條件下MSCs可以分化為

6、角膜上皮樣細胞，為眼表疾病的細胞替代治療提供了新的理論基礎。 方法： 1、無菌條件下取兔骨髓，用密度為1.073的percoll淋巴細胞分離液密度梯度離心法(800g，30分鐘)分離骨髓單核細胞層，DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，以4.0×106/c㎡的密度接種，37℃、體積分數5％CO2孵育箱內培養(yǎng)，正常換液、傳代。當細胞達到60％～70％融合時，加入含有BrdU(濃度為10umol/L)的新鮮DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，以獲

7、得BrdU標記的兔MSCs。 2、無菌條件下環(huán)形取1.5～2mm兔角膜緣組織，撕去角膜內皮層，0.25％DispaseⅡ酶4℃消化18小時后，取角膜上皮層用0.25％胰酶+0.02％EDTA37℃消化10分鐘，1000轉離心10分鐘后，SHEM培養(yǎng)基重懸接種于6孔培養(yǎng)板內，37℃、體積分數5％CO2孵育箱中培養(yǎng)，正常換液、傳代。 3、用流式細胞技術檢測培養(yǎng)MSCs CD29、CD34表達情況。 4、用免疫熒光染色

8、法檢測培養(yǎng)的兔LSCs CK3、Integrinβ1和p63的表達情況。 5、取BrdU標記的兔MSCs，在以下四種不同條件下誘導培養(yǎng)三天。(同時設正常培養(yǎng)MSCs作為陰性對照組) A組：應用Transwell細胞培養(yǎng)板聯合培養(yǎng)兔MSCs和兔LSCs，兔MSCs接種于培養(yǎng)板的上層，兔LSCs接種于培養(yǎng)板的下層，培養(yǎng)基為新鮮SHEM培養(yǎng)基 B組：應用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)兔MSCs，條件培養(yǎng)基為培養(yǎng)過兔LSCs的SHE

9、M培養(yǎng)基上清 C組：應用新鮮SHEM培養(yǎng)基直接培養(yǎng)兔MSCs D組：應用添加10ng/ml EGF的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)兔MSCs 6、用免疫熒光染色和流式細胞術檢測不同時間點，各組MSCs表達CK3的情況。 7、在上述四組體外培養(yǎng)系統中添加表皮生長因子抑制劑(AG1478)誘導培養(yǎng)三天(同時設正常培養(yǎng)MSCs作為陰性對照組)，用免疫熒光染色和流式細胞術檢測不同時間點，各組兔MSCs表達CK3的情況。

10、 8、統計學處理：流式分析數據結果以均值±SD％表示，采用方差分析對各組結果進行比較。(P<0.05有統計學意義) 結果： 1、培養(yǎng)的兔MSCs和兔LSCs形態(tài) 原代兔MSCs培養(yǎng)24小時后鏡下觀察有少量細胞貼壁，細胞呈長梭形，克隆樣生長。12～15天達80％融合，傳代后細胞狀態(tài)無明顯改變。原代培養(yǎng)兔LSCs培養(yǎng)24小時后大多數細胞貼壁，細胞呈不規(guī)則多角形，體積較小。接種3～4天形成含有8～10個細胞的小克

11、隆，10～14天達80％融合，傳代后細胞狀態(tài)無明顯改變。 2、培養(yǎng)的兔MSCs和兔LSCs表型 (1)兔MSCs的流式細胞鑒定：培養(yǎng)的兔MSCs CD29表達陽性的細胞占總細胞數的97.05％；而CD34陽性的細胞占5.15％。 (2)兔LSCs的免疫熒光鑒定：培養(yǎng)的兔LSCs Integrinβ1、p63表達陽性，CK3呈陰性表達。 3、體外誘導培養(yǎng)后兔MSCs的檢測 (1)誘導后兔MSCs的形

12、態(tài)和表型特征：四組不同條件誘導培養(yǎng)的兔MSCs，均有部分細胞失去原有的成纖維細胞形態(tài)，分化為扁平的上皮細胞形態(tài)細胞，免疫熒光染色結果顯示細胞表達CK3。CK3表達最早出現在誘導培養(yǎng)后的2小時，并在誘導培養(yǎng)的三天內無明顯改變。 (2)誘導率分析：流式分析結果顯示，誘導培養(yǎng)第二天各組CK3表達量均有所升高(A組從3.46±1.9％增加到7.24±3.8％；B組從4.09±1.84％增加到9.31±5.92％；C組從3.48±1.39

13、％增加到5.61±3.82％；D組從1.84±0.47％增加到4.73±3.94％)，但第三天均有所降低(A組5.5±3.33％；B組4.37±2.61％；C組2.54±2.01％；D組1.68±0.88％)。各組與對照組比較差異具有統計學意義，但各組間的差異不具有統計學意義。 4、加入抑制劑誘導培養(yǎng)后兔MSCs的檢測 (1)免疫熒光染色結果： A組和B組兔MSCs在誘導培養(yǎng)后2小時，有部分貼壁細胞分化為扁平細胞形態(tài)的細

14、胞，并表達CK3，而后隨時間的延長未見CK3表達增加。C組和D組未見CK3表達陽性的細胞。 (2)流式分析結果：誘導培養(yǎng)三天內A組CK3表達率第一天為1.44±0.18％，第二天升高到1.88±0.69％，第三天略有降低(1.76±0.15％)；B組CK3表達率在第一天為1.3±0.28％，第二天增高到2.73±0.45％，24小時后降低到2.3±1.11％；C組和D組CK3表達率基本穩(wěn)定(C組第一天0.78±0.16％，第二天

15、0.68±0.14％，第三天0.73±0.16％；D組第一天0.62±0.11％，第二天0.7±0.12％，第三天0.56±0.1％)。其中A組與B組間差異無統計學意義，但與對照組比較差異有統計學意義(p<0.05)。C組與D組間差異也無統計學意義，與對照組間比較差異無統計學意義。但A組與C組、D組間差異有統計學意義(均p<0.05)，同樣B組與C組、D組間差異也具有統計學意義(均p<0.05)。 結論： 骨髓間充質干細