海馬齒狀回星形膠質細胞的長時程增強.pdf

1、神經元是神經系統(tǒng)的主要功能細胞，它們通過形成突觸結構，即突觸前末梢和突觸后神經元組成的化學性突觸，執(zhí)行可塑性的突觸信號傳遞，完成神經系統(tǒng)的通訊功能。星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中存在的另一類細胞，它的數目遠遠多于神經元，一直以來被認為僅僅起了支持和營養(yǎng)神經元的作用，是維持神經元正常功能活動的輔助細胞。然而近年來，越來越多的證據支持這些星形膠質細胞也參與了神經元的信號傳遞，主動的調節(jié)突觸傳遞和可塑性。 最近10年來，膠質細胞內鈣信號

2、的發(fā)現被認為是星形膠質細胞對神經元的突觸傳遞和可塑性調控的主要途徑之一。 目前已發(fā)現星形膠質細胞膜上表達有各種各樣的離子通道和神經遞質受體，如各種鉀通道、鈣通道、甚至鈉通道，以及代謝型的和離子型的谷氨酸受體、γ-氨基丁酸受體等。 然而，最近構建成功的GFAP-GFP轉基因小鼠使我們可以在紫外光下看到發(fā)出熒光的膠質細胞，為我們的研究提供了有力的工具。 所以，本研究在GFAP-GFP轉基因小鼠的海馬腦片的齒狀回部位，利

3、用全細胞膜片鉗技術分別記錄星形膠質細胞對穿行傳入纖維刺激產生的電位和電流反應，理解膠質細胞不同于神經元的電生理學特征和其中的機制，以及膠質細胞是否也象神經元一樣，對短串的高頻刺激產生可塑性的改變，進一步研究這種膠質細胞可塑性的機制以及可能對神經元突觸活動的調控。這對我們更好的理解神經系統(tǒng)復雜的學習和記憶功能，以及理解神經(智能)退行性病變的機制、進展和治療都有重要的意義。 膠質細胞電位的組成成份為了理解上述膠質細胞電位不同于神經

4、元突觸后電位的電特性，我們分別使用了膠質細胞膜上受體和轉運體的特異性阻斷劑，用藥理學的方法分離了膠質細胞電位的各個不同組成成份。結果發(fā)現膠質細胞電位能被AMPA/kainate受體特異性的阻斷劑DNQX(10μM)或者是NBQX(20μM)，NMDA受體的特異性阻斷劑APV(50μM)或者是MK-801(30μM)，以及谷氨酸轉運體的抑制劑DHK(300μM)+THA(300μM)所共同抑制。所以我們認為，刺激穿行傳入纖維記錄到的膠質細

5、胞電位主要由三部分組成，分別是膠質細胞膜上AMPA/kainate受體介導的、NMDA受體介導和谷氨酸轉運體介導的去極化電位。 膠質細胞NMDA受體亞單位的逆轉錄PCR分析目前，功能性的NMDA受體蛋白還沒有在海馬的膠質細胞上分離到。而如前所述，我們在膠質細胞上記錄了NMDA受體介導的電流，為了進一步證實在該實驗條件下，NMDA受體在海馬齒狀回的膠質細胞上有表達，采用了單細胞逆轉錄多聚酶鏈式反應對膠質細胞內的NMDA受體亞單位m

6、RNA進行鑒定。結果發(fā)現膠質細胞能轉錄NMDA受體的多種亞單位NR1、NR2A和NR2B。 膠質細胞的長時程增強現象在穿行傳入纖維施加短串的高頻刺激可以誘導顆粒神經元的長時程增強。為了闡明相鄰的膠質細胞對這種條件刺激是否也能產生可塑性的反應，我們在穿行傳入纖維施加相似于誘導神經元長時程增強的高頻刺激，結果在膠質細胞上記錄到了增強的膠質細胞電位反應，而且在高頻刺激后的25-30分鐘，仍然有約300％的增強。說明膠質細胞能夠被誘導出

7、長時程增強反應，而且它的增強幅度和成功率都要大于神經元。 細胞外場電位對膠質細胞長時程增強的影響膠質細胞的低跨膜輸入電阻決定了細胞外的場電位能被膠質細胞內的電極所記錄，那么是否在膠質細胞內記錄到的長時程增強電位是由場電位造成的呢?為此，我們在細胞內應用鉀通道阻斷劑銫離子，縫隙聯接抑制劑CBX(100μM)，用NMG替代細胞內的鈉離子和鉀離子，結果發(fā)現膠質細胞的跨膜輸入電阻升高到了約20MΩ，但它們并不影響膠質細胞的長時程增強。另

8、外，采用電壓鉗記錄膠質細胞電流的方法，以減少場電位的影響，結果發(fā)現膠質細胞電流也有長時程增強反應。 谷氨酸轉運體介導的電流增強不是膠質細胞長時程增強的主要原因海馬齒狀回顆粒神經元能被誘導長時程增強，其機制部分是因為突觸前谷氨酸釋放增加造成了突觸后電位增強，突觸釋放谷氨酸增加也會引起膠質細胞的谷氨酸轉運體電流增強。為了闡明是否膠質細胞的長時程增強來源于增強的轉運體電流，應用DHK(150μM)和THA(150μM)阻斷膠質細胞的谷

9、氨酸轉運體，結果發(fā)現膠質細胞的長時程增強幾乎不受影響。進一步在膠質細胞長時程增強誘導的前后使用離子型谷氨酸受體阻斷劑Kyn，發(fā)現Kyn阻斷了所有的AMPA/kainate受體和NMDA受體后，剩余了轉運體電流，此電流在高頻刺激后比高頻刺激前增加了約60％，說明高頻刺激后，谷氨酸轉運體的活動增強了。但同時也發(fā)現，高頻刺激前，轉運體電流僅占膠質細胞內向總電流的11.3±1.9％，而高頻刺激后，這個比例下降到了6.7±0.6％，說明轉運體介導

10、的電位改變在膠質細胞的長時程增強電位中占了很小的比例。 代謝型谷氨酸受體并未介導膠質細胞的長時程增強代謝型谷氨酸受體(mGluR)可以幫助誘導或者增強神經元的長時程增強，那么膠質細胞膜上的Ⅰ型mGluR是否也參與了膠質細胞長時程增強的誘導或調節(jié)呢?應用Ⅰ型mGluR的抑制劑AIDA(500μM)，發(fā)現它并不影響膠質細胞的長時程增強，說明代謝型谷氨酸受體并未介導膠質細胞的長時程增強。應用Ⅰ型mGluR的激動劑DHPG(30μM)，

11、膠質細胞分化出兩種不同的效應，約50％的細胞表現為長時程增強反應減弱；另約50％的細胞表現為長時程增強反應增強。這可能是DHPG同時激活了Ⅰ型mGluR的兩種亞型受體mGluR1和mGluR5，為此，選用了選擇性的mGluR5受體激動劑CHPG(500μM)，結果它并不影響膠質細胞的長時程增強。 膠質細胞的長時程增強與NMDA受體密切相關為了闡明離子型谷氨酸受體在膠質細胞長時程增強中的作用，我們使用了離子型谷氨酸受體的阻斷劑Ky

12、n(1.5mM)，發(fā)現Kyn能抑制膠質細胞電位到88.8±3.0％，然后給予高頻刺激，后又立即洗脫Kyn，膠質細胞電位能恢復到給藥前水平，但沒有長時程增強。進一步應用了特異型的AMPA/kainate受體阻斷劑DNQX(10μM)或者NMDA受體阻斷劑APV(50μM)，結果兩者分別都能抑制膠質細胞電位，但在高頻刺激后洗脫DNQX，膠質細胞電位不僅恢復，而且出現長時程增強現象，相反，高頻刺激后洗脫APV，僅能恢復到給藥前水平，而不能誘導

13、長時程增強。 膠質細胞長時程增強與細胞內鈣離子的關系在NMDA受體依賴的神經元長時程增強機制中，鈣離子通過開放的NMDA受體進入細胞內，引起細胞內鈣離子濃度升高是誘導神經元長時程增強的關鍵因素。既然上述結果提示，膠質細胞的長時程增強需要NMDA受體參與，那么通過NMDA受體進入膠質細胞內的鈣離子可能也是誘導膠質細胞長時程增強的關鍵因素。為了證明這一假設，通過膜片鉗玻璃電極在膠質細胞內注入鈣離子的螯合劑BAPTA(40mM)，阻斷

14、可能的細胞內鈣離子升高，結果發(fā)現，在高頻刺激誘導后，膠質細胞仍然有長時程增強現象，而且與未注入鈣離子螯合劑的正常對照組相比，并沒有顯著差別。 膠質細胞長時程增強與細胞內蛋白激酶的關系神經元的長時程增強依賴于細胞內一系列的蛋白激酶激活，從而引起突觸后膜上的AMPA受體數目增加以及單通道電導增加。為了了解膠質細胞的長時程增強是否也與一些能調控長時程增強相關的蛋白激酶有關，我們在研究的單個膠質細胞內分別注入了鈣調素依賴的蛋白激酶Ⅱ的抑

15、制劑KN93(2mM)，PKA的抑制劑H89(10μM)和PKC的抑制劑chelerythrione(10μM)，結果發(fā)現它們均不能阻斷膠質細胞的長時程增強。膠質細胞間縫隙聯接的角色膠質細胞通過縫隙聯接連成了一個巨大的緩沖池，能有效的稀釋所有進入膠質細胞的神經遞質和代謝產物。是否這些縫隙聯接也可能稀釋了注入細胞內的各種蛋白激酶抑制劑和鈣離子螯合劑不得而知。為此，在縫隙聯接阻斷劑辛醇(300μM)或者CBX(100μM)存在的情況下，同時

16、細胞內注入40mM的BAPTA，結果發(fā)現膠質細胞的長時程增強電位被顯著的削弱了，然而相應的對照組，只應用了辛醇或者CBX，而并未在細胞內注入BAPTA，膠質細胞的長時程增強電位也被抑制到了相似的程度。說明并非是BAPTA螯合了細胞內鈣離子而抑制了膠質細胞的長時程增強，而是縫隙聯接的阻斷劑直接抑制了膠質細胞電位。 結論1、小鼠海馬齒狀回的星形膠質細胞有不同于神經元的電生理學特性。刺激穿行傳入纖維，能在膠質細胞上記錄到相應的刺激誘導

17、的電位。膠質細胞的去極化電位主要由膠質細胞膜上的AMPA/kainate受體、NMDA受體和谷氨酸轉運體介導。 2、海馬齒狀回的膠質細胞在短串高頻刺激后能誘導出長時程增強，這個增強反應并不是細胞外場電位引起的，也不是增強的谷氨酸轉運體造成的，而主要是由膠質細胞膜上的AMPA/kainate受體介導的。 3、膠質細胞的長時程增強可被NMDA受體阻斷劑所阻斷，但并不能被細胞內的鈣離子螯合劑以及關鍵激酶的抑制劑所阻斷，其可能的