肺臟特絡細胞(telocytes)的研究.pdf

1、特絡細胞(telocytes)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種間充質(zhì)來源的間質(zhì)細胞，由羅馬尼亞L.M.Popescu教授在2005年首次確認，并于2010年正式命名。特絡細胞已被證實存在于哺乳動物體內(nèi)幾乎各種器官及組織中。特絡細胞形態(tài)及超微結構與其他間質(zhì)細胞如成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞等有著顯著不同，其具有特征性的串珠樣細胞突起，可形成3D網(wǎng)絡支架結構。
　　通過組織學和免疫學的方法已經(jīng)證實特絡細胞表面陽性表達CD34、c-kit、viment

2、in，與各種固有細胞如成纖維細胞、免疫細胞、神經(jīng)細胞等互相接觸，參與細胞間的信號轉導，尤其是與干細胞關系密切，可能發(fā)揮著“干細胞輔助細胞”的功能參與組織的損傷修復過程。但是限于在細胞分離、純化、培養(yǎng)等方面的諸多困難，對特絡細胞功能學的研究非常緩慢，目前大多數(shù)研究僅局限于組織學及形態(tài)學方面，僅有少數(shù)專注于細胞生物學功能方面的研究，而且還只是基于細致的組織學觀察而得出的推論和假設，尚缺乏體內(nèi)、體外的細胞實驗進行論證。
　　我們認為某種

3、細胞的結構及其組織分布特征必然與其功能相適應，因此在現(xiàn)有的研究基礎上，本課題應用組織學、細胞分子生物學、基因組學等方法，著重研究特絡細胞在肺臟的定位和分布特征，揭示肺臟特絡細胞與其他間質(zhì)細胞的差異，以及與干細胞的聯(lián)系，闡述其可能的細胞生物學功能，為進一步應用特絡細胞治療肺部疾病奠定理論依據(jù)和實驗基礎。
　　第一部分肺臟特絡細胞的定位與分離培養(yǎng)
　　目的:
　　明確特絡細胞是否存在于肺臟中，揭示特絡細胞在氣管和肺組織中的

4、分布特征，研究特絡細胞的形態(tài)學特征及體外培養(yǎng)的動態(tài)變化。
　　方法:
　　通過電子顯微鏡技術、免疫組織化學技術在肺組織中定位特絡細胞;體外分離小鼠/人肺特絡細胞，通過原代細胞培養(yǎng)、活細胞染色等觀察肺特絡細胞的形態(tài)結構;通過Cell-IQ活細胞工作站動態(tài)觀察肺特絡細胞在體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)學變化;采用流式細胞技術分析特絡細胞的表面生物標記物。
　　結果:
　　掃描及透射電鏡在小鼠氣管軟骨、平滑肌之間的間隙中找到了特

5、絡細胞，其胞體帶有細長的突起telopode;透射電鏡發(fā)現(xiàn)特絡細胞位于肺間質(zhì)，緊鄰毛細血管及小支氣管，在肺干細胞周圍存在大量特絡細胞。Telopode呈管腔樣結構，厚薄交替。免疫組化證實特絡細胞是CD34、c-kit、vimentin陽性細胞。從肺組織中分離、培養(yǎng)的細胞具有典型的特絡細胞特征。流式細胞檢測分析發(fā)現(xiàn)，人肺特絡細胞表面CD44，CD73，CD90，CD105為陽性，CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR表型結

6、果均為陰性，與人骨髓間充質(zhì)干細胞表型一致。體外細胞培養(yǎng)96小時的連續(xù)動態(tài)觀察提示特絡細胞具有游走性、趨化性，細胞間可形成網(wǎng)狀結構，可釋放顆粒物質(zhì)，也可以吞噬其他特絡細胞釋放的顆粒物質(zhì)。
　　結論:
　　氣管和肺組織中也廣泛存在特絡細胞，其分布具有特征性，參與小血管和小支氣管的支架結構，與肺泡上皮細胞以及肺干細胞關系密切。人肺特絡細胞與人骨髓間充質(zhì)干細胞表達相同的生物標記物，特絡細胞具有干細胞的特性。特絡細胞之間可以形成網(wǎng)狀結

7、構，可能參與細胞間的信號傳遞。
　　第二部分肺臟特絡細胞與纖維細胞、間充質(zhì)干細胞的基因差異分析
　　目的:
　　探索特絡細胞與其他間質(zhì)細胞之間的基因差異，找出其特異性表達的基因，明確特絡細胞是否為一類新的間質(zhì)細胞。
　　方法:
　　分離、培養(yǎng)小鼠肺特絡細胞，與小鼠肺成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞一起分別做全基因表達譜分析，對比三種細胞之間的基因表達，尋找其中的差異基因和共表達基因。
　　結果:
　

8、　與小鼠成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞相比較，小鼠特絡細胞有2000個基因高表達，有超過4000個基因低表達。在這數(shù)千個基因中，三種細胞共同表達的基因有156個，進一步通過String Network分析發(fā)現(xiàn)其中又有46個基因之間有不同程度的關聯(lián)性，而小鼠特絡細胞特異性表達Rbp1基因。差異基因主要體現(xiàn)在細胞的發(fā)生、生長過程，解剖與形態(tài)結構等方面。
　　結論:
　　特絡細胞的基因表達與成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞差異巨大，尤其

9、是特異性表達Rbp1基因。特絡細胞是一類新的間質(zhì)細胞
　　第三部分肺臟特絡細胞對血管內(nèi)皮細胞的損傷修復作用
　　目的:
　　探索特絡細胞是否能夠合成分泌與血管生成相關的細胞因子，研究特絡細胞是否能促進血管內(nèi)皮細胞的增殖，促進血管內(nèi)皮細胞的損傷修復。
　　方法:
　　分離、培養(yǎng)小鼠/人肺特絡細胞，分別培養(yǎng)24、48小時，用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子VEGF，EGF，TNF-α，IFN-γ，GM-

10、CSF，MCP-1，TIMP-1，TIMP-2水平;分別以DMEM完全培養(yǎng)基和特絡細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細胞，檢測細胞增殖能力;以脂多糖刺激人肺微血管內(nèi)皮細胞，分別以DMEM完全培養(yǎng)基和特絡細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，用Matrigel膠法檢測微血管內(nèi)皮細胞的小管生成能力。
　　結果:
　　小鼠/人肺特絡細胞培養(yǎng)上清液中與血管生成相關的細胞因子水平升高，尤其是VEGF、EGF。與對照組相比，人肺特絡細胞條件培養(yǎng)基提高了人肺