旋覆花總黃酮抑制血管平滑肌細胞氧化應激和新生內膜形成的分子機制.pdf

1、當血管內皮損傷時，局部募集的炎性細胞可產生大量的活性氧分子（ROS），而ROS又可作為刺激因素，進一步激活血管平滑肌細胞（VSMC）的遷移、增殖、凋亡及細胞外基質分泌等一系列病理事件，導致血管內膜發(fā)生肥厚和硬化等病變。因此，尋找新的有效藥物，抑制損傷誘導的血管氧化應激反應以及由此引發(fā)的心血管疾病己成為藥物研發(fā)的熱點之一。
　　 黃酮類化合物（flavonoids）是自然界中廣泛存在的一類酚類物質，是藥用植物中的主要活性成分。流行

2、病學研究表明，Flavonoids具有抗炎、抗氧化、抗凝血等生理活性，適量攝取可以降低心血管疾病的發(fā)生概率。
　　 歐亞旋覆花（Inula britannica L.）是菊科（compositae）、旋覆花屬多年野生草本植物，性味咸、溫；入肺、腎經。旋覆花總黃酮（TFE）是旋覆花中含量最多的一類活性成分，其含量約占旋覆花干重的10.9％，主要成分包括槲皮素、木犀草素、蘆丁、槲皮苷和異槲皮苷等。其在心血管系統(tǒng)中的抗氧化功效未見報道

3、。本研究觀察TFE對內皮剝脫誘導的血管組織氧化應激和新生內膜形成的干預效應，并在細胞和分子水平上探討其作用機制，旨在挖掘TFE在防治心血管疾病中的藥用價值。
　　 1.旋覆花總黃酮抑制損傷誘導的血管組織氧化應激和新生內膜形成研究證實，ROS是內皮損傷誘導的血管內膜增生的一個重要誘發(fā)因素，具有抗氧化作用的藥物均具有較好的抗血管硬化的臨床療效。TFE具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血、抗衰老、抗腫瘤、降血脂等多種生理活性。然而，TFE對

4、損傷誘導的血管氧化應激和內膜增生的干預效應尚不清楚。本部分研究，以大鼠頸外動脈和腹主動脈球囊剝脫內膜增生模型為對象，觀察TFE對損傷誘導的血管氧化應激和內膜增生的抑制效應和相互關系。
　　 1.1球囊損傷誘導血管內膜增生
　　 形態(tài)學分析顯示，球囊剝脫內皮3天后，血管損傷局部有大量血小板聚集，第7天時內膜出現增厚，14天時增生達到峰值，可見血管內膜向腔內凸起，細胞增多且排列紊亂，內膜呈現彌散性增厚。形態(tài)測量學分析顯示，術

5、后第7天，I/M比值開始升高；14天時，I/M比值較對照組增加50倍左右。表明本實驗復制的球囊剝脫內膜增生模型是成功的。
　　 1.2 TFE劑量依賴性抑制球囊損傷誘導的血管內膜增生
　　 為了觀察TFE抗內膜增生效應，將制備的TFE乳液于術前3天至術后14天以不同劑量（12.5，25，50 mg/kg/d）灌服大鼠。結果顯示，無論是頸總動脈還是腹主動脈，給予高劑量（50 mg/kg/d）TFE組的血管內膜增生程度較模型

6、組明顯減輕；抑制效應與陽性對照藥物阿托伐他汀（ATO）相似，兩組動物的血管腔內徑比模型組均明顯擴大，而中、低劑量TFE的抗內膜增生效應不明顯。
　　 1.3 TFE抑制球囊損傷誘導的血管氧化應激
　　 提示該藥物可提高血管組織的抗氧化能力。
　　 1.4 TFE降低大鼠血管組織中超氧陰離子（O2-）的含量
　　 血管組織O2-的生成量變化與內膜增生程度具有正相關關系。
　　 1.5 TFE上調血管

7、組織中SOD蛋白的表達
　　 Western blot分析和免疫組化染色結果顯示，從假手術組的血管組織中可檢測到較高水平的SOD蛋白；而球囊損傷14天后，血管中SOD含量明顯降低，約為對照組的60％左右；給予TFE干預后，血管中的SOD含量有所增加，接近對照組水平，尤其在新生內膜的管腔側，可見大量的SOD陽性染色顆粒。
　　 1.6 TFE抑制球囊剝脫誘導的VSMC的表型轉化
　　 對分化型VSMC標志基因SM2

8、2α的Western blot分析顯示，球囊損傷不同時間后，SM22α表達量呈進行性下降，表明VSMC由分化型向去分化型轉化；給予TFE干預治療后，損傷誘導的SM22α表達活性降低受到明顯抑制，表明該藥物可抑制VSMC表型轉化。
　　 2.旋覆花總黃酮體外抑制血管平滑肌細胞氧化應激
　　 在動物整體水平上證明TFE能夠抑制球囊損傷誘導的血管內膜增生和氧化應激的基礎上，為進一步探討TFE調制血管氧化應激的作用機制，本部分以

9、H2O2為誘導劑，建立VSMC氧化應激模型，給與TFE干預，同時以槲皮素（TFE的主要成分之一）為對照，比較觀察兩種制劑對VSMC氧化應激的調制效應。
　　 2.1 H2O2對VSMC生長的影響
　　 MTT分析結果表明，低濃度的H2O2（100-400μmol/L）處理VSMC后，不影響細胞活力和生長速度，高濃度的H2O2（>800μmol/L）具有明顯的細胞毒性作用。本研究采用200μmol/L H2O2的終濃度用于

10、后續(xù)實驗。
　　 2.2不同劑量TFE和槲皮素對VSMC生長的影響
　　 結果表明，TFE對細胞增殖的直接抑制效應較弱。
　　 2.3 TFE抑制VSMC中O2-的生成
　　 DHE染色結果顯示，200μmol/L H2O2刺激VSMC24 h后，與對照組相比，細胞內紅色熒光的亮度明顯增強，提示細胞內O2-生成明顯增多。
　　 2.4 FFE抑制H2O2誘導的MDA生成
　　 表明TFE和

11、槲皮素均可抑制H2O2誘導的MDA的生成，二者具有相同的功效。
　　 2.5 FFE上調SOD活性
　　 表明TFE和槲皮素均可以部分逆轉H2O2導致的SOD活性降低。
　　 3.旋覆花總黃酮抑制血管平滑肌細胞p47phox表達和磷酸化
　　 p47phox的表達活性、磷酸化水平和膜轉位速率的變化，均可直接影響細胞ROS的生成。
　　 本研究部分在已經確證TFE具有抑制血管ROS生成，加快O2-清

12、除的基礎上，以p47phox為切入點，對TFE減少ROS產生的上游機制進行了探討。
　　 3.1 H2O2誘導VSMC中p47Phox的表達
　　 結果提示，H2O2對p47phox表達的誘導效應具有濃度和時間依賴性。
　　 3.2 TFE抑制內皮損傷誘導的血管p47phox的表達
　　 免疫組化結果顯示，球囊剝脫內皮14天后的血管新生內膜中，可見有大量p47phox陽性染色的VSMC，彌散性分布于新生內

13、膜區(qū)：而給予TFE藥物的血管，其新生內膜肥厚程度減輕的同時，p47phox陽性的細胞數也大大減少。Western blot分析得到了相似的結果，在球囊損傷3天時，p47Phox水平開始升高，約為對照組的1.9倍；到第14天時達到高峰，約為對照組的4倍左右；預先給予TFE藥物干預組，其損傷誘導的p47phox的表達上升被部分抑制，與14天的模型組相比降低50％以上。
　　 3.3 TFE和槲皮素抑制H2O2誘導的VSMC中p47p

14、hox的表達
　　 為了在細胞水平上進一步驗證TFE對p47phox似表達的抑制效應，用TFE處理VSMC，以槲皮素作為陽性對照。表明TFE和槲皮素可抑制H2O2誘導的VSMC中p47phox的基因轉錄。
　　 3.4 FFE和槲皮素抑制H2O2誘導的p47phox的磷酸化
　　 免疫沉淀分析結果顯示，對照組VSMC中，p47phox的磷酸化水平相對較低，H2O2刺激VSMC15 min、30 min、1 h后，

15、p47phox磷酸化水平快速、短暫升高，于刺激15 min時即達高峰，隨后略有降低，但仍高于正常水平。
　　 4.旋覆花總黃酮對ERK1/2、AKT和NF-κB信號通道的調制作用
　　 血管內皮損傷局部募集的炎性細胞除釋放多種致炎因子外，還可產生大量的ROS，后者可通過影響胞內信號分子的磷酸化修飾，而誘導細胞產生氧化應激。細胞內有多條信號通路參與介導ROS誘導的p47Phox磷酸化過程。
　　 4.1 FFE和槲

16、皮素抑制內皮損傷和H2O2誘導的ERK1/2的磷酸化
　　 免疫組化和Western blot分析檢測了TFE和槲皮素對氧化應激誘導的ERK1/2磷酸化的影響，結果顯示，球囊剝脫損傷14天后，模型組大鼠血管新生內膜VSMC中有大量磷酸化ERK1/2陽性染色顆粒；而給藥組大鼠新生內膜肥厚程度減輕的同時，血管組織中磷酸化ERK1/2陽性顆粒數量明顯減少。
　　 4.2 TFE和槲皮素抑制H2O2誘導的Akt的磷酸化
　

17、　 Western blot結果顯示，不同條件處理的VSMC，其總Akt表達量基本一致，但磷酸化Akt的水平存在明顯差異。
　　 4.3 TFE和槲皮素能夠抑制H2O2誘導的NF-κB p65亞基的核轉位
　　 結果表明，TFE和槲皮素可不同程度地抑制H2O2誘導的NF-κB p65的核轉位，而槲皮素單體具有更強的抑制效應。
　　 結論:
　　 1.FFE通過上調總SOD蛋白表達和活性、促進O2-的清除

18、，降低球囊損傷誘導的血管氧化應激，進而抑制血管新生內膜形成和由此導致的血管狹窄。
　　 2.TFE可以部分逆轉H2O2導致的SOD活性降低、降低MDA水平、促進O2-的清除，從而抑制VSMC氧化應激。
　　 3.TFE可抑制p47phox基因的轉錄和蛋白表達及磷酸化活化，該效應是TFE減少ROS生成和抑制氧化應激的分子機制之一。
　　 4.TFE對ROS誘導的ERK1/2、Akt和NF-κB信號通路的激活具有不同