Foxp3在小鼠腎移植免疫耐受中的研究.pdf

1、第一部分小鼠腎移植模型的建立
　　目的: 建立穩(wěn)定的小鼠腎移植模型，為利用小鼠研究移植免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法: 雄性、成年、健康、近交系C57BL/6小鼠40只。采用異位異體腎移植，充分暴露供腎，在摘取小鼠供腎前，先進(jìn)行灌注。將移植腎動(dòng)、靜脈分別與腹主動(dòng)脈及下腔靜脈行端側(cè)吻合，尿道重建采用將供腎輸尿管末端引入膀胱內(nèi)加外固定的方法。術(shù)后均不使用抗生素和免疫抑制劑。小鼠存活超過(guò)五天認(rèn)為手術(shù)成功。
　　結(jié)果: 建模初期

2、共完成40例。僅有11例完成了手術(shù)全過(guò)程。建模成熟穩(wěn)定期共完成40例手術(shù)。術(shù)后24h小時(shí)存活率為85％(34/40).術(shù)后1w生存率為70％(28/40)。供體手術(shù)時(shí)間為(27±6) min，熱缺血時(shí)間約10～15s，供腎血管修整時(shí)間為(2.36±0.43)min.冷缺血時(shí)間(55±13) min，受體手術(shù)為(94±16) min，其中腹主動(dòng)脈及下腔靜脈阻斷時(shí)間為（42.18±5.43）min.手術(shù)失敗的12只小鼠主要原因?yàn)槌鲅孕菘?

3、例，吻合口血栓形成5例，動(dòng)脈吻合口狹窄2例，原因不明2例。
　　結(jié)論:
　　1采用改良方法建立的小鼠腎移植模型穩(wěn)定可靠，術(shù)后7天為本實(shí)驗(yàn)的最佳研究時(shí)間，建模的成功可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　2小鼠腎移植模型手術(shù)難度大，高質(zhì)量的血管吻合以及細(xì)致的顯微操作是提高小鼠腎移植手術(shù)成功率的關(guān)鍵。
　　第二部分體外實(shí)驗(yàn)中Foxp3對(duì)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞抑制功能的研究
　　目的: 探討Foxp3轉(zhuǎn)染CD4+CD25-T細(xì)胞后

4、在體外淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響，并研究其在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的作用機(jī)制。
　　方法: 免疫磁珠法分離出CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25T細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外介導(dǎo)Foxp3基因進(jìn)入CD4+CD25-T細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)Foxp3的表達(dá)。以小鼠脾臟細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，將Foxp3轉(zhuǎn)染的CD+CD25-T細(xì)胞、CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、脾臟單個(gè)核細(xì)胞為刺激細(xì)胞，各取5×105按照1∶1比例分為三組?；旌吓囵B(yǎng)三天后，加

5、入3H-TdR微居，以液閃測(cè)定儀測(cè)定三組的cpm值。
　　結(jié)果: Foxp3轉(zhuǎn)染后CD4+CD25-T細(xì)胞可見(jiàn)高水平的表達(dá)。Foxp3轉(zhuǎn)染CD4+CD25T細(xì)胞后具有與CD4+CD25+T細(xì)胞相同的抑制作用。三組cpm值比較:A組Foxp3（3，009.28±211.63）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組（2877.11±121.43）增殖活性明顯低于空白對(duì)照組（12817.34±768.21），差異具有顯著性。Foxp3組與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組之間

6、無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1 Foxp3是CD4+CD25+T細(xì)胞發(fā)育、發(fā)生和功能的關(guān)鍵因子;
　　2 Foxp3轉(zhuǎn)染后的CD4+CD25-T細(xì)胞可明顯抑制淋巴細(xì)胞的增殖活化。
　　第三部分 Foxp3在小鼠腎移植模型中的作用研究
　　目的: 研究Foxp3在腎移植排斥反應(yīng)中的作用和機(jī)制，探討在腎移植中通過(guò)Foxp3因子介導(dǎo)的CD4+CD25+T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)特異性免疫耐受的可能性及機(jī)制。
　　方法:

7、建立小鼠腎移植模型后，實(shí)驗(yàn)分為三組:A組:為對(duì)照組N=12，以脾臟單個(gè)核細(xì)胞為作用細(xì)胞，于移植前一天取1×106細(xì)胞注入受體小鼠體內(nèi)。B組:調(diào)節(jié)性T細(xì)胞組，N=12，以CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為作用細(xì)胞，同樣條件下，移植前一天取1×106經(jīng)小鼠尾靜脈注入受體體內(nèi).C組:Foxp3+CD4+CD25-T細(xì)胞組，N=12，以PLXSN-mFOXP3-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染的CD4+CD25-T細(xì)胞為作用細(xì)胞;同樣條件下，于移植前一天

8、取1×106細(xì)胞經(jīng)小鼠尾靜脈注入受體體內(nèi)。A、B、C組分成2個(gè)亞組，一個(gè)亞組于7天術(shù)后處死，切取移植腎行病檢，下腔靜脈取血ELISA法檢測(cè)IL-2、IFN-γ、 IL-10的含量;一個(gè)亞組用于檢測(cè)小鼠移植術(shù)后生存期長(zhǎng)短。
　　結(jié)果: 三組小鼠生存期長(zhǎng)短比較:和A組比較，B、C組小鼠生存期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01);而B(niǎo)、C組之間比較未見(jiàn)顯著性差異。血清中IL-2、IFN-γ、IL-10在各組間的水平表達(dá):IL-2、IFN-γ在A組水

9、平明顯高于B、C組。與B、C組間有明顯差異。IL-10在B、C組的表達(dá)水平明顯升高，與A組比較差異具有顯著性。IL-2、IFN-γ、IL-10在B、C組比較未見(jiàn)顯著差異。小鼠移植腎病理切片表達(dá):A組小鼠出現(xiàn)明顯急性排斥反應(yīng);B組小鼠急性排斥反應(yīng)明顯改善，未見(jiàn)明顯急性排斥反應(yīng)組織學(xué)表現(xiàn);C組小鼠急性排異反應(yīng)同樣明顯改善，部分有輕度的缺血再灌注損傷。
　　結(jié)論:
　　(1) Foxp3在抑制腎移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著