根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)層出鐮刀菌遺傳轉(zhuǎn)化及T-DNA側(cè)翼序列的獲得.pdf

1、近年來，蘋果再植病害成為我國蘋果主栽區(qū)品種更替及果園重建的主要制約因素，我們在前期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌是引起河北省蘋果再植病害的主要病原菌，層出鐮刀菌是其中一種重要致病菌。目前國內(nèi)外對層出鐮刀菌在蘋果再植病害上的報(bào)道很少。而層出鐮刀菌在蘋果再植病害中的致病機(jī)制尚未見報(bào)道。為了解層出鐮刀菌的致病機(jī)理，從基因?qū)用娼沂静≡L發(fā)育及致病相關(guān)基因，探索病害防治的新靶標(biāo)，本研究以層出鐮刀菌H10菌株作為T-DNA插入突變的原始菌株，利用前期優(yōu)化的

2、體系建立了T-DNA插入突變體庫，并對獲得的部分突變體的生長速率、產(chǎn)孢能力、致病力及插入拷貝數(shù)及插入側(cè)翼序列進(jìn)行了初步分析。主要結(jié)果如下:
　　1.借助實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，分別利用農(nóng)桿菌AGL-1和含有綠色熒光蛋白標(biāo)記的農(nóng)桿菌LBA4404構(gòu)建了插入突變體庫，農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化共獲得766個(gè)突變體，經(jīng)PCR鑒定有386個(gè)轉(zhuǎn)化子含有800bp左右的目的條帶，陽性率為49.61％;農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

3、共獲得2620個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選107個(gè)轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定，100個(gè)轉(zhuǎn)化子均能夠擴(kuò)增出含有1000bp左右的目的條帶，陽性率為93.45％。
　　2.經(jīng)潮霉素B鑒定，連續(xù)轉(zhuǎn)接5代轉(zhuǎn)化子的顏色和菌落形態(tài)沒有改變;用熒光顯微鏡對含有綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行觀察能發(fā)現(xiàn)綠色熒光。表明外源基因已經(jīng)插入到H10基因組中并且能夠穩(wěn)定遺傳。
　　3.對利用兩種農(nóng)桿菌獲得的轉(zhuǎn)化子，各選取100個(gè)進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生長速度、產(chǎn)孢能力和致病力分析。與野

4、生菌株相比，農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子中3％的轉(zhuǎn)化子生長速率減慢，10％的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)孢量下降，轉(zhuǎn)化子的致病力均有不同程度的減弱，未發(fā)現(xiàn)致病力完全喪失的轉(zhuǎn)化子。
　　4.從完成了產(chǎn)孢量和致病力測定的轉(zhuǎn)化子中，選取10個(gè)進(jìn)行了Southern雜交分析，結(jié)果顯示9個(gè)為單拷貝插入。
　　5.使用8個(gè)通用引物，利用TAIL-PCR對產(chǎn)孢量和致病力下降并且為單拷貝插入的轉(zhuǎn)化子H10-989進(jìn)行了側(cè)翼序列擴(kuò)增。結(jié)果表明，AD3引物的擴(kuò)增效