抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體制備及其檢測(cè)方法的建立.pdf

1、小麥赤霉病菌產(chǎn)生的毒素不僅在病害發(fā)展過(guò)程中具有加重赤霉病的作用，而且污染谷物導(dǎo)致嚴(yán)重的食用安全性問(wèn)題.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是其產(chǎn)生的最重要的一種毒素，由于DON的危害嚴(yán)重，引起了各國(guó)的普遍重視，建立快速、靈敏、有效的毒素檢測(cè)方法顯得十分迫切，真菌毒素的檢測(cè)傳統(tǒng)上一直是以色譜化學(xué)技術(shù)為依托，但免疫檢測(cè)方法具有檢測(cè)快速、費(fèi)用低廉、易于操作、簡(jiǎn)單易攜、且高靈敏度等特點(diǎn)，近年來(lái)日益受到國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注.本試

2、驗(yàn)旨在制備可用于檢測(cè)被脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染的糧谷類特異性單克隆抗體，本試驗(yàn)首先將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的衍生物3-半琥珀酰.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-HS-DON)與卵清蛋白(OVA)采用碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到人工抗原，以此人工抗原免疫BAL B/C小鼠，取該鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選和克隆，得到了1株能穩(wěn)定分泌DON抗體的單克隆細(xì)胞株(382)，并制備單克隆抗體腹水.經(jīng)檢測(cè)382的抗體類型及亞類均為IgG1，

3、其輕鏈為k鏈.腹水通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定效價(jià)在1×107以上.該單克隆抗體與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特異性結(jié)合反應(yīng)的50％抑制質(zhì)量濃度為29μg/L，除與3-acetyldeoxynivalenol(3-Ac-DON)的交叉反應(yīng)率為78.38％，與其他脫氧雪腐鐮刀菌烯醇結(jié)構(gòu)類似物無(wú)交叉反應(yīng)，具有較高的靈敏度和特異性，有較好的應(yīng)用價(jià)值。 本研究成功制備的高親合力和高特異性的抗DON單克隆抗體，為建立谷物和農(nóng)產(chǎn)品中DON的快速免疫檢測(cè)技

4、術(shù)奠定了基礎(chǔ).選取雜交瘤細(xì)胞株382所分泌的抗體進(jìn)行研究，建立了ELISA檢測(cè)體系，其檢測(cè)條件為：樣品提取液甲醇的濃度為8％，包被抗原3-HS-DON-BSA濃度2pg/mL，腹水稀釋至1×10-7，2％卵清蛋白(OVA)作為封閉物；OD450吸光值作縱坐標(biāo)與DON濃度(μg/mL).的對(duì)數(shù)值作橫坐標(biāo)建立檢測(cè)曲線，在0.01μg/mL-10μg/mL范圍內(nèi)呈顯著線性關(guān)系，檢測(cè)方程為y=0.2396x+0.3177，相關(guān)系數(shù)迭0.9999