平滑肌細胞特異性Smad4基因敲除小鼠的建立.pdf

1、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是TGF-β超家族的成員，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-βs通過細胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型受體活化細胞內信號轉導分子Smads而實現(xiàn)其廣泛的功能，Smad4是TGF-β信號轉導中的核心樞紐分子，它與受體依賴的Smads結合調節(jié)下游靶基因的表達。大量的研究顯示它在心血管疾病中發(fā)揮著重要的作用。本研究的目的是利用Cre/LoxP系統(tǒng)建立

2、平滑肌細胞特異性Smad4基因敲除小鼠并進行初步表型分析，期望獲得一種可用于研究TGF-β在心血管疾病中的作用機制的動物模型以及建立一種分離原代平滑肌細胞的方法，為從基因敲除小鼠體內獲得原代平滑肌細胞并在體外研究TGF-β對其功能影響提供技術手段。
　　 本研究選擇了平滑肌細胞特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠(SMA-Cre)作為介導敲除的工具鼠，將其與ROSA26報告基因小鼠交配獲得了SMA-Cre；ROSA26雙轉基因小鼠

3、，通過LacZ染色顯示在其主動脈壁的平滑肌細胞有特異性藍染，說明SMA-Cre能在血管平滑肌細胞中特異的表達。接著用SMA-Cre轉基因小鼠與Smad4條件基因打靶小鼠交配獲得了在平滑肌細胞特異性Smad4基因敲除小鼠，通過擴增Smad4剔除條帶和原位免疫熒光顯示敲除小鼠中Smad4發(fā)生了敲除。Smad4基因敲除小鼠無胚胎致死，能夠順利出生，大約70％的基因敲除小鼠在6-8周齡死亡。Smad4基因敲除小鼠在6周的時候出現(xiàn)腹主動脈瘤。本研

4、究用膠原酶消化法分離小鼠原代平滑肌細胞，免疫熒光鑒定此方法獲得的平滑肌細胞。用這種方法分離平滑肌細胞特異性Smad4基因敲除小鼠的主動脈的原代平滑肌細胞，用免疫熒光，Western blot及Real-time PCR檢測了敲除小鼠來源的原代平滑肌細胞中Smad4的表達，發(fā)現(xiàn)分離出來的原代平滑肌細胞獲得了穩(wěn)定遺傳的Smad4敲除。
　　 實驗結果顯示本研究成功建立了平滑肌細胞特異性Smad4基因敲除小鼠并能自發(fā)形成腹主動脈瘤。建