TRAIL及其受體在ATRA誘導胰腺癌細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、背景和目的：維甲酸類藥物可以誘導多種腫瘤細胞凋亡已得到證實，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)則由于其選擇性誘導腫瘤凋亡的特性而倍受重視。本課題組前期實驗已證實全反式維甲酸(ATRA)對人胰腺癌細胞株Patu8988有誘導凋亡作用，通過GEArray<’TM> Q基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)ATRA使TRAIL受體表達上調。本研究將在此基礎上試圖進一步闡明ATRA促進多種人胰腺癌細胞株凋亡的作用機制，并建立胰腺癌動物模型期望在體內實驗中加以

2、證實。同時研究TRAlL及其受體在ATRA誘導前后表達的變化。通過轉染pCAl3/TRAIL質粒研究TRAIL促進胰腺癌細胞凋亡的作用。并進一步觀察ATRA和TRAIL在誘導凋亡和調控TRAIL受體上有無協(xié)同作用。 方法：用MTT方法觀察不同濃度ATRA對人胰腺癌細胞株SWl990、Patu8988和Bx-PC3活性的影響。通過流式細胞儀檢測ATRA誘導24、48和72h后細胞的凋亡率，并通過TUNEL和Hoechst雙染、透

3、射電鏡觀察證實凋亡的存在。將SWl990和Bx-PC3細胞接種于裸鼠皮下，成瘤后在裸鼠體內擴增傳代，建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型，然后分別給予ATRA 40mg/kg每曰口服或400nmol隔日瘤內注射，并設無干預組和空白溶劑組，每周兩次觀察移植瘤的大小變化，繪制移植瘤生長時間曲線。4-6周將裸鼠處死，取瘤稱重，根據實驗組和對照組瘤重計算抑瘤率。對移植瘤組織進行HE染色、電鏡觀察、nYNEL和Hoechst雙染、免疫組化檢測Caspase-

4、3和TRAIL-R1、R2的表達，抽提細胞、組織的RNA和蛋白通過RT-PCR和Western blot檢測TRAIL mRNA和蛋白的表達。通過免疫組化和流式細胞儀檢測并計算胰腺癌細胞株ATRA誘導前后TRAIL-R1、R2的變化。經酶切及PCR鑒定證實后，轉染pCA13/TRAIL質粒，用GFP法測轉染效率，設空質粒對照組，轉染后24h加或不加ATRA誘導24h和48h，MTT法測活性，電鏡觀察、TUNEL和Hoechst雙染、免疫

5、組化檢測Caspase-3證實凋亡的存在，流式細胞儀檢測細胞凋亡率、周期、TRAIL-R1、2的變化。 結果：MTT法顯示ATRA對三種人胰腺癌細胞株SWl990、Patu8988和Bx-PC3的生長均有顯著抑制作用，與對照組差異顯著(P<0.05)。ATRA誘導后TUNEL和Hoechst雙染、透射電鏡觀察證實凋亡的存在，流式細胞儀檢測顯示誘導24h后細胞凋亡率在10-30％，并隨誘導時間延長而增加。通過腫瘤細胞皮下接種，體

6、內擴增傳代的方法成功建立了兩種胰腺癌細胞株裸鼠移植瘤模型。ATRA40mg／kg口服和400nmol瘤內注射后移植瘤體積和瘤重均明顯小于對照組(P<0.05)，Bx-PC3抑瘤率為64.24％和55.78％，SWl990為44.03％和49.13％。移植瘤組織HE染色、電鏡觀察可見腫瘤細胞形態(tài)改變及誘導后凋亡細胞的出現(xiàn)。ATRA干預后細胞、組織內TUNEL和Hoechst雙染、免疫組化檢測Caspase-3和TRAIL-R1、2陽性率均

7、高于對照。ATRA誘導后TRAIL mRNA和蛋白的表達增加。轉染TRAIL質粒后SWl 990、Patu8988和Bx-PC3轉染效率分別為69.88±9.92％、26.52±10.01％和38.60±11.02％，TRAILmRNA和蛋白的表達在轉染后24h出現(xiàn)，48h達高峰。轉染pCAl3／TRAIL質粒凋亡率和TRAIL-R1、2陽性率高于空質粒組，細胞周期主要被阻滯于GO／G1期。聯(lián)用ATRA后，進一步促進胰腺癌細胞株的凋亡，

8、但TRAIL-R1、2的表達并無進一步增加。 結論：成功建立了兩種人胰腺癌細胞株裸鼠移植瘤模型。通過體內外實驗證實ATRA對多種人胰腺癌細胞株有誘導凋亡的作用，并能抑制腫瘤的生長。TRAIL能將細胞周期阻滯在GO／G1期，上調其受體1、2，活化Caspase-3，促使細胞凋亡。ATRA上調TRAIL及其受體1、2，通過TRAIL依賴的凋亡途徑促使細胞凋亡，但這并非ATRA誘導胰腺癌細胞凋亡的唯一途徑。聯(lián)用ATRA和TRAIL進