芪術顆?！盎鐾ńj”作用對肝竇毛細血管化影響的研究.pdf

1、本課題對肝纖維化“瘀血阻絡”病機理論進行了探討,并對芪術顆粒“化瘀通絡”作用影響肝竇毛細血管化的機制進行了研究。
　　 1理論研究部分
　　 通過對中醫(yī)學及現(xiàn)代醫(yī)學肝纖維化相關文獻的整理分析,在課題組多年深入研究的基礎之上,對肝纖維化現(xiàn)代醫(yī)學研究概況、中醫(yī)學絡病理論在肝纖維化防治中的應用及“化瘀通絡”在肝纖維化防治中的作用等方面進行了初步的探討。
　　 依據(jù)絡病理論,肝纖維化的病位主要在肝絡,是由濕熱疫毒、情志郁

2、結(jié)等諸多病因長時間作用于肝臟及相關臟腑所導致的一種疾病。其病機主要是肝絡氣血運行的異常,釀痰生瘀阻于肝絡,致使其滲灌濡養(yǎng)肝體、疏通暢達氣血功能失常,“瘀血阻絡”是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要病機。所以在治療上,應當以“化瘀通絡”為一個治療重點,結(jié)合病人整體情況,辨證施治。
　　 結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學對肝纖維化的研究進展,發(fā)現(xiàn)肝竇毛細血管化作為影響正常肝細胞和肝竇血液間的物質(zhì)交換的重要因素,在肝纖維化的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)治療中起著重要的作用,

3、而肝竇毛細血管化又可歸屬于肝纖維化“瘀血阻絡”概念范疇,其可能是肝纖維化“瘀血阻絡”病機的重要內(nèi)容之一。
　　 2實驗研究部分
　　 目的:觀察芪術顆粒對四氯化碳所致肝纖維化形成階段大鼠模型肝竇毛細血管化的干預作用,闡釋芪術顆?！盎鐾ńj”作用防治肝竇毛細血管化及肝纖維化的作用機制。
　　 方法:采用四氯化碳腹腔注射法復制肝纖維化形成階段模型大鼠,同時予芪術顆粒灌胃預防,并設立空白對照及模型對照組。分別于造模的第

4、4及第8周取大鼠肝臟組織,切取肝臟標本約1mm3,迅速置入4℃2.5％戊二醛固定,經(jīng)鋨酸、環(huán)氧樹脂及醋酸鈾-檸檬酸鉛等固定、包埋、切片染色后,使用JEOL JEM-1400型透射電子顯微鏡觀察肝細胞、肝竇壁超微結(jié)構及肝竇毛細血管化改變。同時,取左外葉約2cm×1.5cm×0.5cm大小肝組織于10％甲醛溶液固定,行層粘連蛋白(LN)及Ⅳ型膠原(Co-Ⅳ)免疫組化染色制片,奧林巴斯IX70熒光倒置顯微鏡觀察切片黃染的深淺與面積,測定每張切

5、片黃染部分的累積光密度值(IOD),定量分析LN、Co-Ⅳ的在大鼠肝臟中的沉積情況。另外,取約200mg新鮮肝組織于-80℃液氮中保存,行實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各組大鼠肝臟血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1電鏡觀察結(jié)果
　　 空白對照組大鼠肝細胞多為單核多角形,細胞核圓且多位于細胞中央。可見多種細胞器,數(shù)個細長粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊管聚在一起,平行排列。線粒體呈圓形或卵

6、圓形,基質(zhì)深暗,數(shù)量多,遍布細胞各處,嵴的數(shù)量中等。肝細胞內(nèi)常可見糖原粒和脂滴。內(nèi)皮細胞有窗孔,Disse間隙間可見由肝細胞向間隙內(nèi)凸起的微絨毛。
　　 模型對照組可見大量肝細胞凋亡,線粒體水腫,細胞器溶解,細胞呈空泡樣變,相鄰肝細胞間邊界不清、細胞連接消失。細胞胞核深染,胞質(zhì)濃縮,細胞內(nèi)糖原顆粒消失。毛細膽管腔擴張,其內(nèi)微絨毛消失。形成毛細膽管的相鄰肝細胞的質(zhì)膜連接處的緊密連接結(jié)構消失,膽汁滲入肝細胞胞漿內(nèi)。并且隨著造模時間的

7、延長,以上改變呈現(xiàn)出日益加重的情況。同時隨著造模時間的增長,肝竇內(nèi)皮細胞窗孔消失,內(nèi)皮細胞下形成連續(xù)基膜,肝竇管腔擴張,Disse間隙變窄,細胞質(zhì)混沌不清。
　　 芪術顆粒組可見肝細胞再生活躍,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加,細胞器溶解消失,細胞間連接重現(xiàn)。8周組大鼠肝臟細胞較4周組細胞損傷嚴重,但其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較4周組為多。4周及8周組大鼠毛細膽管內(nèi)微絨毛重現(xiàn),肝竇內(nèi)皮細胞窗孔重現(xiàn)。Disse間隙有所恢復,但內(nèi)皮細胞下基膜仍存在?？傮w來看,以上

8、改變4周組較8周組大鼠為輕。
　　 2芪術顆粒對Ⅳ型膠原及層粘連蛋白的影響
　　 空白對照組LN在大鼠肝組織匯管區(qū)血管壁有少量分布,Co-Ⅳ則少量分布于靜脈、匯管區(qū)等部位,二者著色均為棕黃色。模型對照組及芪術顆粒組大鼠肝組織LN、Co-Ⅳ IOD值均較空白組有顯著增加(13.89±1.70vs1.61±0.65,15.92±1.96vs1.43±0.59；12.24±1.80vs1.33±0.56,17.82±2.94v

9、s1.48±0.33,P<0.01),且模型對照組大鼠肝組織LN、Co—Ⅳ表達IOD值隨著實驗時間的延長亦顯著增加(13.89±1.70vs15.92±1.96；12.24±1.80vs17.82±2.94,P<0.01)。芪術顆粒組大鼠肝組織LN、Co-Ⅳ IOD值較模型組顯著為低(8.15±2.01vs13.89±1.70,9.64±1.97vs15.92±1.96；7.32±2.11vs12.24±1.80,11.49±3.31v

10、s17.82±2.94,P<0.01),且隨實驗時間延長,芪術顆粒組大鼠肝組織LN及Co-ⅣIOD值增長幅度均要較模型對照組為低(9.64±1.97vs8.15±2.01,11.49±3.31vs7.32±2.11)。
　　 3芪術顆粒對VEGF mRNA表達的影響
　　 模型對照組大鼠肝臟VEGF mRNA表達量在第4、8周兩個時間點較空白組均存在顯著的差異(0.33±0.02vs0.01±0.01,0.61±0.44

11、vs0.03±0.03,P<0.01)。芪術顆粒組大鼠肝組織VEGF mRNA表達量與模型對照組相比在第4周存在明顯降低(0.25±0.06vs0.33±0.02,P<0.05),第8周雖較模型對照組為低但未見顯著性差異(0.59±0.35vs0.61±0.44)。
　　 結(jié)論:
　　 1、芪術顆?？梢詼p輕四氯化碳對肝細胞的損傷作用,保護肝細胞結(jié)構的完整,促進肝細胞修復,減輕內(nèi)皮下連續(xù)基底膜的形成及內(nèi)皮細胞失窗孔的嚴重程