脂肪來源干細胞在整形外科的應用研究.pdf

1、目的：建立兔脂肪間充質(zhì)干細胞的體外分離培養(yǎng)方法，鑒定并分析其生物學特性，并探索脂肪組織來源干細胞體外培養(yǎng)的最佳條件。觀察大鼠自體脂肪來源干細胞的皮下移植成活的情況。嘗試用兔脂肪來源干細胞來解決擴張皮瓣淤血問題。探索脂肪來源干細胞在人體體表軟組織缺損復合脂肪組織移植的臨床應用。觀察人脂肪來源干細胞復合脂肪移植人體表軟組織缺損臨床效果。
　　 方法：①選用新西蘭大白兔，無菌取出腹股溝脂肪，膠原酶法分離出兔脂肪干細胞，并進行體外培養(yǎng)，

2、取2代以后的兔脂肪干細胞觀察其形態(tài)特征，并繪制細胞生長曲線及倍增時問。比較了不同膠原酶濃度、膠原酶消化時間和血清濃度對于脂肪來源干細胞體外培養(yǎng)的不同效果。②60只Vistar大鼠隨機分為3組，每組20只，實驗組取自體腹股溝區(qū)皮下脂肪組織，用Ⅰ型膠原酶消化法提取脂肪間充質(zhì)干細胞并進行傳代培養(yǎng)，然后用脂質(zhì)體法對細胞進行eGFP(增強型綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)染標記。實驗對照組的細胞轉(zhuǎn)染標記后，利用G418將細胞其滅活?？瞻讓φ战M為生理鹽水。分別將其

3、注射移植至大鼠自體耳廓皮下層次，分別于注射后第2、4、6周時進行冰凍切片觀察并定量分析所形成組織量的轉(zhuǎn)歸情況。③20只新西蘭大耳白，左耳、右耳隨機排列，10ml擴張器在耳背皮下植入，定期注水，于第20天取出擴張器，并形成皮瓣，制做淤血模型。同時，實驗組取自體腹股溝區(qū)皮下脂肪組織，用Ⅰ型膠原酶消化法提取脂肪問充質(zhì)干細胞并進行傳代培養(yǎng)，然后對細胞Dil染色標記?？瞻讓φ战M為生理鹽水。分別將其注射移植至兔形成皮瓣的皮下層次，在注射后于第2周時

4、觀察皮瓣的成活情況，并進行病理切片觀察和CD34兔疫組織化學染色，定量分析所形成組織量的成活情況和血管發(fā)生情況。2008年4月至2010年4月共收治體表軟組織缺損患者共12例，病因有放療遺留軟組織萎縮、手術遺留缺損、年齡老化致鼻唇溝加深、眉間紋加深等。與患者交流后，都愿意嘗試脂肪來源干細胞復合脂肪移植填充體表軟組織缺損。局部腫脹麻醉下，取自體腹部或雙側大腿皮下脂肪組織，用Ⅰ型膠原酶消化法提取脂肪間充質(zhì)干細胞，濃集(2×106/ml)后即

5、時與自體脂肪混合靜置半小時后注射移植，采用多點、多層次、少量多次的注射方法，術后適度加壓包扎。
　　 結果：①兔脂肪干細胞原代及傳代細胞形態(tài)：原代及傳代的兔脂肪干細胞均呈長梭形或多邊形貼壁生長，生長分化活躍。②兔脂肪干細胞的生長曲線及倍增時間：傳代的兔脂肪干細胞生長曲線呈“s”形，倍增時間為55 h。③兔脂肪干細胞的成脂分化誘導，經(jīng)油紅染色的辦法，其成脂分化的陽性率為65％。④采用0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml

6、、2mg/ml四種不同膠原酶濃度進行消化后發(fā)現(xiàn)，在消化時間為1h時，2mg/ml組細胞總數(shù)最多，活細胞比率與其他組有統(tǒng)計學差異。在消化時間為2h時，細胞總數(shù)較1h各組均增加，同時，1mg/ml組、1.5mg/ml組和2mg/ml組消化細胞總數(shù)無統(tǒng)計學差異，活細胞比率1mg/ml組和1.5mg/ml組最高。采用5％、10％、15％、20％五種不同血清濃度培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，15％和20％組生長特性最佳，明顯優(yōu)于另三組。④實驗組切片內(nèi)可見明顯綠色熒

7、光組織層存留，其體積在各個時間點沒有明顯的變化。(P＜0.01)⑤實驗組皮瓣成活的長度明顯長于對照組，病理切片顯示CD34染色密度明顯高于對照組。(P＜0.01)。術后半年隨訪填充脂肪維持注射量，無明顯吸收。
　　 結論：①本次實驗所分離出來的兔脂肪干細胞在體外具有生長穩(wěn)定，增殖較快的特點。脂肪組織來源干細胞，膠原酶濃度1mg/ml、消化時間2h、血清濃度15％是最佳的培養(yǎng)條件。②單純自體脂肪來源干細胞的皮下移植可以存活，并且形