FAK信號通路在脈絡膜新生血管發(fā)生中的作用.pdf

1、研究背景:脈絡膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)是年齡相關性黃斑變性(agerelatedmaculardegeneration，AMD)導致視力喪失的最主要的原因之一，其發(fā)病機制至今尚不十分清楚。視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)細胞可以通過調節(jié)自身多種基因的表達，對缺氧和代謝變化等周圍環(huán)境的刺激產生快速的應答。在CNV發(fā)生的啟始階段，RPE細胞分泌細胞

2、因子和生長因子，促進CNV的生成。隨后，增生的脈絡膜血管穿破Bruch膜生長至RPE和/或視網(wǎng)膜下，形成CNV。
　　CNV的發(fā)生機制十分復雜，受到生長因子和細胞黏附信號等多種因素的影響。參與調控CNV生成的RPE細胞接受多種來源的信號，如可溶性細胞因子信號和細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)信號等。黏著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)，一種非受體型酪氨酸激酶，在細胞骨架和整合素/

3、細胞因子受體信號的鏈接中發(fā)揮重要的作用，并參與調控細胞增生、存活、移行和分化等細胞進程。ECM和可溶性細胞因子均可活化FAK。進來的研究還表明，F(xiàn)AK參與了新生血管的應答，并且在病理性視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生中發(fā)揮重要的調控作用。然而，F(xiàn)AK在CNV發(fā)生中的作用尚未見相關報道。
　　目的和內容:探討FAK在CNV發(fā)生中的作用，進一步闡明CNV的發(fā)生機制。在建立激光誘導的大鼠CNV模型基礎上，觀察FAK的表達與CNV生成的相關性；體外觀察

4、多種已知與CNV生成相關的危險因素的作用下，培養(yǎng)的人RPE細胞中FAK的表達；運用小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)特異性抑制RPE細胞FAK的表達，觀察FAK信號通路在CNV發(fā)生中的作用。
　　方法:⑴激光擊穿Bruch膜，建立挪威(BrownNorway，BN)大鼠CNV模型。分別于激光光凝后1、3、7和14天，免疫熒光和Westernblot方法觀察大鼠CNV中FAK的表達；⑵體外原代培養(yǎng)人R

5、PE細胞，分別暴露于缺氧、H2O2氧化衰老、ECM成分和吞噬光感受器外節(jié)膜盤(outsegmentofphotoreceptors，POS)等刺激因素。Westernblot方法觀察RPE細胞中FAK的表達；⑶運用siRNA技術特異性抑制RPE細胞FAK的表達，RT-PCR、Westernblot和ELISA等方法觀察缺氧條件下RPE細胞缺氧誘導因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)和血管內皮生長

6、因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表達；⑷原代培養(yǎng)牛脈絡膜微血管內皮細胞(choroidalendothelialcells，CEC)，建立RPE-CEC共培養(yǎng)體系。采用MTT和結晶紫染色等方法觀察特異性抑制FAK表達的RPE細胞對CEC增生和移行的影響。
　　結果:⑴在激光誘導的BN大鼠CNV生成早期(光凝后1d、3d)，RPE-脈絡膜復合體中FAK表達顯著升高，隨后表達逐漸下降。

7、免疫熒光檢測顯示，F(xiàn)AK的表達上調主要定位于參與CNV生成的RPE細胞中；⑵體外實驗表明，目前已知的多種與CNV生成相關的影響因素，如缺氧、氧化衰老、POS代謝產物在胞內堆積以及Bruch膜破裂導致的RPE與ECM成分的接觸等，均可不同程度上調RPE細胞內FAK的表達；⑶成功構建了pSilencer/FAK表達載體，通過脂質體介導轉染RPE細胞可有效下調FAK的表達。運用siRNA特異性抑制RPE細胞FAK的表達后，可以顯著抑制缺氧誘導

8、的RPE細胞HIF-1α和VEGF的表達上調；⑷成功原代培養(yǎng)牛CEC細胞，利用細胞共培養(yǎng)體系觀察到RPE細胞與CEC共培養(yǎng)可以刺激CEC的增生和移行，缺氧條件下刺激作用增強。而運用siRNA特異性抑制RPE細胞FAK的表達后，可以顯著抑制缺氧條件下RPE細胞對CEC增生和移行的誘導作用。
　　結論:本研究首次證實FAK信號參與了激光誘導的大鼠CNV的生成，提示CNV發(fā)生早期，活化的RPE細胞內FAK表達的上調參與CNV生成的調控。

9、體外實驗表明，多種已知與CNV生成相關的刺激因素均可不同程度上調RPE細胞FAK的表達，進一步提示FAK在CNV發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調控作用。特異性抑制RPE細胞FAK的表達，可以顯著抑制缺氧誘導的RPE細胞HIF-1α和VEGF的表達上調，并進而抑制CEC增生和移行，進一步明確了FAK對CNV生成的調控作用。綜上，F(xiàn)AK信號參與了CNV生成過程的調控，此類研究在國內外尚未見報道。針對FAK的siRNA可以抑制CNV生成，這將為臨床防