PAK1在大腸癌演進和轉移中的作用.pdf

1、背景與目的 大腸癌(colorectal carcinoma,CRC)是常見的惡性腫瘤，全球每年新增病例近 1000000例，492000例死亡。隨著經(jīng)濟的進步，生活方式和飲食結構的變化，我國大腸癌每年發(fā)病率也快速遞增，特別是大城市上升趨勢更為顯著。大腸癌男女發(fā)病率等同，在40歲以后發(fā)病危險度隨著年齡增加而遞增；資料顯示我國大腸癌男性發(fā)病率約為16.2/100000，女性約為14.5/100000，大腸癌已經(jīng)成為我國致死性腫瘤中

2、最常見的死亡原因之一。然而，大腸癌的治療效果并不理想，在所有的病人中約有半數(shù)患者治療失敗。大腸癌傳統(tǒng)治療方法，即外科手術治療、放射治療和化學藥物治療方法的不斷發(fā)展和完善，在延長患者生存期和提高患者生存質量方面取得了長足的進步；但是手術和放療是局部治療，難以控制腫瘤的復發(fā)和轉移，化療藥物往往缺乏組織選擇性和特異性，對骨髓等正常人體重要器官和組織產(chǎn)生嚴重的毒副作用，在過去幾十年，大腸癌的五年生存率一直徘徊在40～50％左右。因此，探尋大腸上

3、皮細胞癌變，演化和轉移的機制，特別是尋找早期腫瘤標志物，以期早期發(fā)現(xiàn)和干預大腸癌的生物學進程，對大腸癌的治療具有重要的意義。 p21-activated kinase-1(PAKl)即p21小GTP酶活化激酶1，是第一個被克隆和驗證的的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質磷酸化激酶家族成員。PAK是分子量為21KD、Rho家族的小GTP酶(small GTPases)，即Cdc42和Rac的下游效應分子。在分子結構上，PAK N-末端為激酶的調

4、節(jié)區(qū)，C-末端為激酶的底物結合區(qū)，具有激酶活性。PAK1-3構成第一組PAK，分子量為62-64 KD，其激活需要Cdc42和Rac，除調節(jié)胚胎發(fā)育、正常的細胞生長，分化和凋亡外，PAK家族成員還在人類疾病中起重要作用。PAK1是PAK家族中與人類腫瘤關系密切的成員，其在細胞骨架修復、延長正常細胞壽命和正向調節(jié)一些正常生理代謝等方面都起重要作用。PAKl只在腦、肌肉和脾臟正常組織表達，其他組織表達很少，但在很多人類腫瘤細胞都高表達PAK

5、l，尤其是在乳腺癌和卵巢癌細胞中PAKl的表達遠高于其它腫瘤細胞，而且PAKl表達與乳腺癌和卵巢癌細胞的增殖和侵襲轉移呈正相關。但PAKl在大腸癌的發(fā)生發(fā)展、演化和轉移中的作用機制尚未明確，因此本課題在系統(tǒng)地檢測PAKl在大腸癌旁正常組織一息肉一腺瘤一原發(fā)性大腸癌組織一大腸癌轉移癌瘤組織中的表達差異和分布特點基礎上，同時構建PAKl真核表達載體和PAKl shRNA真核表達載體，轉染大腸癌SW480細胞，觀察上調和下調大腸癌細胞PAKl

6、表達后對大腸癌細胞增殖、凋亡，細胞粘附、運動、侵襲和致瘤等表型的改變，以期深入了解PAKl在大腸癌細胞演化和轉移中的作用和機制，并探討PAKl作為大腸癌轉移標志和作為潛在治療靶點的可能性。 材料與方法 一、PAKl在良、惡性大腸病變中的表達及其臨床意義用免疫組織化學S-P法檢測PAKl在大腸癌癌旁正常粘膜、大腸息肉、大腸良性腺瘤、大腸癌和大腸癌轉移瘤組織中的表達，并分析PAKl表達與大腸癌臨床病理特征的關系。 二

7、、PAKl對大腸癌細胞表型的影響為檢測PAKl對大腸癌細胞增殖、粘附、移動和侵襲等表型的影響，利用基因重組技術分別構建PAKl真核表達載體和PAKl shRNA真核表達載體(RNA interference,RNAi)，并以大腸癌細胞SW480作為模型，轉染重組載體后觀測對大腸癌SW480細胞表型的影響，并分析PAKl在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中的作用及其可能機制。 1、PAKl真核表達重組質粒的構建按照Genbank上公布的PA

8、Kl mRNA序列(NM 002576)，在其編碼區(qū)(CDS)設計兩端帶有EcoRI和BamH I酶切位點的引物，利用聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增PAKl CDS區(qū)，EcoRI和BamH I雙酶切純化的PCR產(chǎn)物和真核表達載體pEGFP/C1，T<,4>連接酶連接酶切純化后的PCR產(chǎn)物和酶切純化后的pEGFP/C1，轉化到大腸桿菌DH5a中，挑單菌落培養(yǎng)擴增，提取重組質粒后行EcoRI

9、和BamH I雙酶切鑒定，選擇插入片段正確的克隆測序鑒定。 2、PAKl shRNA重組載體的構建根據(jù)siRNA設計的原則，在PAKl mRNA(NM 002576)CDS設計三對siRNA核苷酸序列，并設計一對非相關核苷酸序列作為對照，經(jīng)Genbank在線BLAST確定確定與其它人類基因無高度同源后，分布在所設計的siRNA兩端分別加上帶有BamH I和EcoRI酶切位點的 shRNAs(shott hairpin RNAs)

10、單鏈送公司合成，配對單鏈核苷酸退火復性合成雙鏈，按常規(guī)操作把shRNA序列克隆到pRNAT-U6.1/Neo載體中，重組質粒酶切和測序鑒定。 3、轉染細胞和建立穩(wěn)定轉染細胞克隆采用Invintrogen公司的Lipofectamine 2000<'TM>脂質體進行細胞轉染。細胞轉染48h后用分別用80μg/ml G418篩選陽性細胞克隆，挑取單克隆細胞擴增培養(yǎng)。 4、PAKl表達調控效應檢測逆轉錄聚合酶鏈式反應fReve

11、rse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印跡、免疫細胞化學與激光共聚焦顯微鏡檢測PAKl mRNA和蛋白質水平表達改變。 5、細胞增殖與凋亡MTT法檢測PAKl對大腸癌細胞SW480增殖的影響；采用DNA片段法檢測PAKl對5-Fu誘導的細胞凋亡的影響。 6、細胞基質粘附實驗參照文獻的方法研究PAKl對大腸癌細胞SW480粘附的影響。 7、單層細

12、胞劃痕愈傷實驗分析單層細胞劃痕愈傷實驗分析PAKl對大腸癌細胞移行的影響，參照文獻操作。 8、侵襲實驗觀察改變PAKl表達對大腸癌細胞侵襲能力的影響。 9、軟瓊脂糖集落形成實驗觀察RNAi沉默PAKl表達對SW480細胞錨著獨立性生長的影響。 10．明膠酶譜實驗觀測PAKl對SW480細胞基質金屬蛋白分泌和活性的影響。 11、裸鼠成瘤實驗觀察PAKl表達對SW480細胞裸鼠成瘤的影響，包括成瘤瘤體大小、侵

13、襲轉移部位差異。 三、統(tǒng)計學分析所得數(shù)據(jù)用SPSSl2.0 for Windows軟件，免疫組織化學采用等級資料多個獨立樣本和兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗；其它數(shù)據(jù)行單向方差分析(One-Way ANOVA)，組間多重比較用LSD方法進行分析，以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，以P≤0.05為有顯著性差異。 結果 1、PAKl在良、惡性大腸病變中的表達及其臨床意義免疫組織化學檢測結果表明PAKl主要在細胞胞漿表達，

14、胞核偶有少量表達，而在大腸上皮細胞外基質中基本不表達。 2．PAKl shRNA真核表達載體經(jīng)酶切和測序證實插入序列與設計序列完全一致； 3、重組質粒轉染SW480經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定細胞克隆株； 4、與對照細胞比較，RT-PCR和Western blotting從mRNA和蛋白水平證實SW480內源性PAKl被PAKl shRNA抑制； 5、選取PAKl shRNA中一個克隆細胞株用作后續(xù)實驗，并

15、把其細胞克隆命名為 SW480<'shRNAl>，非相關序列細胞克隆命名為SW480<'shRNA-N>;PAKl真核載體細胞克隆株命名為Sw480<'PAKl>，pEGFP/C1質粒對照細胞克隆命名為SW480<'svector>； 6、細胞增殖實驗顯示，在各組細胞孵育24h后，各組細胞間增殖有顯著性差異； 8、細胞-基質粘附實驗結果顯示各組細胞之間粘附細胞明顯不同，8W480<'shRNAl>細胞顯著減少，與SW48

16、0細胞相比(P=0.015)和與SW480<'shRNA-N>相比較P=0.018)，而SW480細胞與SW480<'shRNA-N>細胞之間比較無顯著性差異；SW480<'PAKl>與SW480相比(P=0.004)和與SW480<'vector>相比(P=0.004)，細胞粘附顯著增加。 9通過軟瓊脂糖克隆形成實驗可以觀察細胞錨定獨立性生長的能力，從而反映細胞的惡性程度。 結論 1、免疫組織化學檢測顯示PAK

17、l表達從腺瘤到腫瘤、從原發(fā)大腸癌到轉移大腸癌依次增加，提示PAKl在大腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中起重要作用。 2、上調PAKl表達可以促進大腸癌細胞SW480增殖，下調PAKl表達則可以抑制大腸癌細胞SW480的增殖； 3、PAKl可以增強大腸癌細胞的異質粘附，下調PAKl表達則抑制SW480細胞的異質粘附； 4、PAKl增強大腸癌細胞的非錨定式依賴式生長，下調PAKl表達則抑制大腸癌細胞的集落形成能力； 5