豬SP-D檢測和真核表達及其對弓形蟲基因疫苗免疫增強效應研究.pdf

1、表面活性蛋白D(SP-D)屬于膠原凝集素家族成員，是黏膜上皮細胞分泌的一個模式識別蛋白，其在機體對各種病原體的先天免疫反應中具有重要的作用。
　　大量研究已表明，SP-D可作為多種疾病的生物標記物。為了提高對SP-D表達水平的檢測效率，本研究建立了實時熒光定量PCR和金納米PCR方法。本研究根據(jù)豬SP-D mRNA基因序列(nm_214110)設計并合成引物和TaqMan探針，PCR擴增得到豬SP-D基因CDS區(qū)序列，并連接pMD

2、-18T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD-SP-D作為陽性標準質(zhì)粒。試驗優(yōu)化了實時熒光定量PCR的反應條件，建立了標準曲線方程:Y=-3.131X+35.09，擴增效率達108％，R2達到0.999，CT值的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于3％。標準CT值與模板的初始濃度呈良好的線性關系，可以檢測到的最低濃度為3copies/μL。在這項研究中還建立了金納米PCR方法，在優(yōu)化的反應條件下進行其特異性，靈敏度檢測。結(jié)果表明，金納米PCR方法能擴增出與實驗

3、設計相一致的特異條帶，其敏感性與特異性均優(yōu)于普通PCR。應用金納米PCR方法檢測豬胸膜肺炎外周血清樣品，結(jié)果表明金納米PCR方法可用于臨床檢測。
　　在建立檢測方法的同時本研究構(gòu)建了含SP-D全基因序列的重組質(zhì)粒PMD-SP-D,以此為模板，以具有限制性酶切位點SalⅠ，HindⅢ的特異性引物PCR擴增了SP-D基因，PCR產(chǎn)物克隆至SalⅠ/HindⅢ酶切線性化的載體pFastBac HTb，通過酶切位點和測序鑒定該重組質(zhì)粒構(gòu)建

4、成功。將重組載體pFastBac HTb轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)，進行X-gal篩選和PCR驗證，結(jié)果表明，成功擴增豬SP-D基因，并構(gòu)建了克隆載體pFastBac SP-D,重組載體轉(zhuǎn)化成功轉(zhuǎn)化后得到重組Bac-SP-D表達載體，將其轉(zhuǎn)染Sf9細胞后成功表達重組SP-D蛋白。經(jīng)純化后得到純度較高的重組SP-D蛋白，采用SP-D ELISA試劑盒分析結(jié)果顯示，以桿狀病毒為載體的重組SP-D蛋白具有生物活性。該部分實驗建立了體外表達具有生

5、物活性的豬SP-D的方法，為研究其在豬體免疫調(diào)節(jié)中的作用和在疫苗及藥物的應用開發(fā)奠定了物質(zhì)基礎。
　　多年來，T.gondii基因疫苗已成為T.gondii疫苗研究的熱點，但其免疫效率低。研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)機體固有免疫穩(wěn)態(tài)和記憶T細胞中SP-D與細胞因子發(fā)揮了關鍵作用，為驗證SP-D與核酸疫苗共同免疫是否可以提高其療效，在已驗證重組SP-D蛋白具有生物活性的基礎上，本研究以表達T.gondii頂端膜抗原1(AMA1)的DNA疫苗PcD

6、NA3.1-AMA1免疫小鼠，采用MTT試驗和血清抗體檢測對在基因疫苗佐劑PcDNA3.1-SP-D存在或缺乏狀況下的免疫反應進行了分析。間接免疫熒光法(IFA)和免疫熒光共聚焦激光掃描顯微鏡(LSCFM)表明，SP-D可以在體外細胞中表達，且外源蛋白被分散在整個細胞質(zhì)。采用MTT法檢測結(jié)果表明，相對PcDNA3.1-AMA1組，PcDNA3.1-SP-D+ PcDNA3.1-AMA1組淋巴細胞被誘導的增殖胞反應更顯著(P＜0.05)。

7、AMAI抗體檢測表明，PcDNA3.1-SP-D+ PcDNA3.1-AMA1組AMA1抗體水平增長顯著(P＜0.001)。該試驗結(jié)果表明了PcDNA3.1-SP-D在T.gondii基因疫苗免疫中的基因佐劑作用，為T.gondii疫苗免疫及治療效率提高提供了可行方案，為進一步研究預防和治療Toxoplasmosis奠定了基礎。
　　本研究對微量SP-D mRNA檢測提供了兩種高效的檢測方法，為推廣SP-D mRNA作為疾病生物標

8、記物的檢測和金納米粒子PCR的應用提供了實驗依據(jù)。同時體外表達了具有生物活性的豬SP-D的方法，重組蛋白可以用于研究其在豬體免疫調(diào)節(jié)中的作用，對重組SP-D蛋白在疫苗和藥物的應用開發(fā)奠定了基礎。本研究首次構(gòu)建了PcDNA3.1-SP-D DNA疫苗，并驗證了PcDNA3.1-SP-D在T.gondii基因疫苗免疫中的基因佐劑作用，進一步驗證了SP-D的免疫增強作用，同時為T.gondii疫苗免疫及治療效率提高提供了可行方案，為進一步研究