黃瓜綠斑駁花葉病毒與甘蔗花葉病毒基因組測序及種群遺傳結構分析.pdf

1、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）和甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）是農作物上的兩種重要病毒，其分布范圍廣，危害重，給我國農業(yè)生產的發(fā)展造成了嚴重威脅。本論文主要圍繞CGMMV和SCMV兩個病毒的基因組測序及種群遺傳結構分析、SCMV單克隆抗體制備及其應用等開展相關研究，取得如下研究結果:
　　1、7個CGMMV浙江分離物基因

2、組測序及種群遺傳結構分析
　　利用以CGMMV單抗為核心建立的dot-ELISA方法對采自浙江省不同地方的762份葫蘆科作物、4批葫蘆科作物種子及60份雜草樣品進行CGMMV普查。結果顯示，葫蘆植株及其種子、西瓜植株及其嫁接苗、甜瓜植株等樣品中均檢測到CGMMV。另外，在田間雜草碎米芥和空心蓮子草中檢測到CGMMV的存在，這是CGMMV感染雜草的首次報道。根據CGMMV在浙江省的地理分布及不同作物上的發(fā)生情況，從中選取感染CGMM

3、V的4株西瓜植株、2株西瓜嫁接苗和1株甜瓜植株樣品進行病毒全基因組克隆和測序，獲得了7個CGMMV浙江分離物全基因組序列。測序結果表明，CGMMV臺州西瓜分離物和建德西瓜分離物的全基因組序列長度分別為6425 bp和6423 bp，2個東陽西瓜分離物全基因組序列長度分別為6423 bp和6425 bp，蕭山西瓜嫁接苗和東陽西瓜嫁接苗分離物全基因組序列長度分別為6423 bp和6424 bp，CGMMV建德甜瓜分離物全基因組序列長度為64

4、23 bp。同源性分析發(fā)現這7個分離物全基因組核苷酸同源性在99.2～100％之間。結合GenBank登錄的24個CGMMV分離物構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，除分離物Ec外，其它分離物根據地理來源的不同分為兩組，即亞洲分離物聚在組Ⅰ，歐洲分離物聚在組Ⅱ，表明CGMMV的種群分化極有可能受地理分布的影響。CGMMV全基因組核苷酸序列位點變異分析發(fā)現，其各個位點的變異率均在8％以下，大多集中在2～5％之間，表明CGMMV基因組較保守、變異較少

5、。CGMMV堿基替換突變類型分析顯示，其具有轉換(A(←→)G和C(←→)T)明顯強于顛換（A(←→)C、A(←→)T、G(←→)C和G(←→)T）的偏好性。發(fā)生在CGMMV基因組上的大多數變異均導致了非同義突變的產生，且由于堿基替換類型的強烈偏好性，一些氨基酸位點出現了高于30％的非同義替代率。選擇壓分析結果顯示，在復制相關蛋白186 kDa和129 kDa ORF中檢測到強烈的負向選擇壓，這與報道的發(fā)生在其它RNA病毒中的情況類似。

6、最后，分離物Ec的重組分析發(fā)現，在多個重組檢測中分離物Ec作為重組體的可信度均較低。
　　2、SCMV云南分離物的基因組測序及種群遺傳結構分析
　　利用RT-PCR的方法檢測來自云南田間的1個玉米樣品，發(fā)現其感染SCMV。隨后進行該分離物（命名為SCMV-YN）基因組克隆和測序，得到不合poly(A)長9598 bp的全基因組序列。這是SCMV云南玉米分離物在全基因組序列上的首次報道。基因組結構預測顯示，SCMV-YN分離物

7、的CI蛋白中典型的RNA解旋酶結構域V1215LLLEPTRPL1224突變成了V1215LLIEPTRPL1224，NIb蛋白C末端的原核脂蛋白結構域I2554LAFNYTLLSC2564突變成I2554IAFNYAMLSS2564。與GenBank登錄的28個SCMV分離物全基因組核苷酸序列進行同源性比對發(fā)現，SCMV-YN與河北玉米分離物SCMV-BD8的同源性遠遠高于其它分離物，達到95.2％，且在這些分離物中，P1變異最大，C

8、I和PIPO相比其它ORFs保守得多?；谌蚪M核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹顯示29個SCMV分離物被分為兩組，即組Ⅰ和組Ⅱ。且在兩大組內部又各分為兩小組，分別為組Ⅰ A(Maize)、組ⅠB(Maize/Sugarcane)和組Ⅱ A(Maize/Sugarcane)、組Ⅱ B(Sugarcane)。且地理分布對分離物親緣關系的影響有所弱化，寄主來源對分離物親緣關系的影響依然存在。SCMV全基因組核苷酸位點變異分析發(fā)現，其各個位點變異程度

9、存在明顯波動，大多集中在15～20％之間，表明SCMV基因組存在高變異率。SCMV堿基替換突變類型與報道的其它RNA病毒類似，呈現轉換（A(←→)G和C(←→)T）明顯強于顛換（A(←→)C、A(←→)T、G(←→)C和G(←→)T）的偏好性。遺傳差異及基因流分析顯示，組Ⅰ和組Ⅱ分離物在所有ORFs中均存在顯著的遺傳差異;同時在P3、NIa-VPg、NIa-Pro和NIb-replicase等ORFs中檢測到頻繁的基因流。選擇壓分析顯示

10、，SCMV分離物編碼的所有ORFs均處于負向（凈化）選擇壓下，且CI ORF受到的負向選擇壓最大。重組分析顯示，29個SCMV分離物中7個分離物檢測到明顯重組。且對這7個分離物的重組區(qū)域進行分析發(fā)現，除P3ORF外，其它區(qū)域均檢測到了重組。
　　3、SCMV-YN分離物單抗的制備及其應用
　　用提純的SCMV-YN病毒粒子免疫BALB/c小鼠，經細胞融合、篩選與克隆成功獲得9株能分泌SCMV單抗的雜交瘤細胞株(6A1、6A1

11、2、10B11、12A10、15C12、19F3、21C12、21H3和22A2），并制備單抗腹水。9株單抗腹水的間接ELISA效價在10-6～10-7之間，抗體類型及亞類均為IgG1、kappa輕鏈。Western blot分析發(fā)現，6A1、21H3和22A2這3個單抗對SCMV-YN和SCMV北京分離物均具有免疫反應，說明它識別的是這兩個分離物外殼蛋白亞基的共同抗原決定簇;而10B11、12A10、15C12、19F3和21C12這

12、5個單抗僅對SCMV-YN分離物具有免疫反應，說明它識別的是SCMV-YN分離物外殼蛋白亞基的特異性抗原決定簇。6A12單抗在Western blot時不識別SCMV外殼蛋白等病毒結構蛋白，結合其dot-ELISA結果推測該單抗識別的是針對構象型的抗原決定簇。以制備的單抗為核心建立dot-ELISA檢測方法，并對其特性進行分析。特異性分析顯示，6A1、21H3和22A2這3個單抗及以其為核心建立的dot-ELISA方法在檢測SCMV-Y

13、N和北京分離物時均呈陽性反應;而6A12、10B11、12A10、15C12、19F3和21C12這6個單抗及以其為核心建立的dot-ELISA方法在檢測SCMV-YN和北京分離物時，僅對SCMV-YN分離物呈陽性反應，這說明其可用于SCMV-YN分離物的株系鑒定和檢測。dot-ELISA方法分析單抗靈敏度顯示，6A1、15C12、10B11和21H3單抗對病葉的檢測靈敏度均達到1∶10240倍稀釋（w/v, g/mL），12A10和1