shRNA表達載體沉默Bcl-2基因、抑制B細胞淋巴瘤生長的實驗研究.pdf

1、目的：B細胞淋巴瘤與抗凋亡基因Bcl-2的過表達密切相關，調(diào)低該基因的表達將有助恢復細胞凋亡功能，逆轉(zhuǎn)腫瘤形成。RNA干擾(RNAi)能高效特異地調(diào)低基因表達，已廣泛應用于腫瘤治療的研究。本課題通過構(gòu)建Bcl-2shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B細胞淋巴瘤Raji細胞，體內(nèi)、外觀察shRNA表達載體對Raji細胞Bcl-2基因表達的影響，以及對Raji細胞生長的抑制作用，為進一步研究B細胞淋巴瘤的基因治療奠定實驗基礎。 方法：①軟件分析B

2、cl-2mRNA結(jié)構(gòu)以篩選出擬干擾靶位點，構(gòu)建Bcl-2shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009，同時構(gòu)建陰性對照重組質(zhì)粒pGenesil-1-NC，經(jīng)測序和酶切鑒定后，提取各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Raji細胞；②實驗分為空白對照組、pGenesil-1-Bcl-2-544組、pGenesil-1-Bcl-2-1009組和pGenesil-1-NC組進行體內(nèi)、外實驗。③在48h時測定細

3、胞凋亡和Bcl-2mRNA相對含量，以觀察各干擾重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Raji細胞后對Bcl-2基因表達的抑制作用；④G418篩選獲得各重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細胞，RT-PCR、FCM、Western-blotting測定Bcl-2mRNA和蛋白的表達，細胞計數(shù)測定細胞增殖能力：⑤各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細胞接種BALB/c裸鼠，建立B細胞淋巴瘤荷瘤裸鼠模型；通過觀測成瘤時間、瘤體積和瘤重量，免疫組化測定Bcl-2蛋白表達，透射電鏡觀察瘤細胞

4、超微結(jié)構(gòu)，研究Bcl-2shRNA對B細胞淋巴瘤移植瘤生長的抑制作用。 結(jié)果：①測序和酶切鑒定證實重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544、pGenesil-1-Bcl-2-1009和pGenesil-1-NC均成功構(gòu)建；②瞬時轉(zhuǎn)染48h時，pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組的凋亡指數(shù)分別是空白對照組的4.70和3.78倍(p<0.05)，對Raji細胞Bcl-2基因

5、表達的抑制率分別為31.91％和47.61％(與對照組相比，p<0.05)；③G418成功篩選出各重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Raji細胞，F(xiàn)CM測得各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞百分率均達97％以上；pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009對Raji細胞Bcl-2mRNA的抑制率分別為72.71％和45.50％，與對照組相比差異具有顯著性意義(p<0.05)；FCM測得Bcl-2蛋白抑制率分別為73.37％和59.

6、67％(與對照組相比，p<0.05)，Western-blotting結(jié)果與FCM結(jié)果基本相符；對各組細胞增殖速度的比較表明，兩干擾組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的增殖能力明顯下降；④pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組移植瘤的平均成瘤時間明顯延遲，平均瘤體積、重量明顯下降，切片的免疫組化結(jié)果進一步證實兩干擾組Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào)，透射電鏡顯示兩干擾組瘤細胞有一定比例的凋亡；⑤穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表

7、明：pGenesil-1-Bcl-2-544組對Bcl-2基因的干擾作用較pGenesil-1-Bcl-2-1009組明顯，抑制瘤細胞的增殖也更明顯；而pGenesil-1-NC對Raji細胞Bcl-2基因無明顯干擾作用，對瘤細胞的增殖無明顯影響。 結(jié)論：成功構(gòu)建Bcl-2shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009；兩干擾重組質(zhì)粒能在體內(nèi)、外干擾Raji細胞Bcl-2基