有機陽離子轉(zhuǎn)運體和CYP酶在Nitidine轉(zhuǎn)運及毒性中的作用.pdf

1、原小檗堿類生物堿包括小檗堿、黃連堿、藥根堿、氯化兩面針堿、小檗紅堿等，藥理作用廣泛，臨床常用于抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、降糖等。小檗堿、藥根堿、黃連堿等活性成分可由多年生草本植物黃連、三角葉黃連等植物根莖提取，氯化兩面針堿(Nitidine Chloride，NC)是從藥用植物兩面針Zanthoxylum nitidine(Roxb) DC根中分離得到的生物堿?，F(xiàn)代研究證明，NC具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用，尤其在抗腫瘤方面，由于其抗瘤譜廣，

2、對肺癌、口腔鱗癌、肝癌等許多惡性腫瘤具有較強的抑制作用，具有潛在的開發(fā)價值和應用前景。
　　有機陽離子轉(zhuǎn)運體(organic cation transporters, OCTs)，包括OCT1，OCT2和OCT3，在體內(nèi)主要負責轉(zhuǎn)運小分子有機陽離子或中性化合物，包括內(nèi)源性化合物和一些外源性底物。人肝臟表達OCT1，OCT3，而腎臟則表達OCT2。原小檗堿類生物堿為含氮的叔氨或季氨生物堿，在生理pH7.4的條件下以陽離子或中性化合物

3、的形式存在，因此，推測肝細胞膜上的OCT1及OCT3，腎細胞膜上表達的OCT2可能介導這類生物堿在肝、腎細胞的攝取。為深入了解OCT1，OCT2和OCT3在這類生物堿肝、腎細胞處置中的作用，并考察由此引起的體內(nèi)外毒性，本研究首先考察該類生物堿與OCT1/OCT2的相互作用，進而選擇氯化兩面針堿(NC)，采用多種轉(zhuǎn)基因細胞模型、人肝臟微粒體、人重組CYP酶及整體動物模型，研究由轉(zhuǎn)運體OCTs介導的NC跨膜轉(zhuǎn)運、肝細胞中CYP450介導的代

4、謝、藥代動力學特征及其體內(nèi)外毒性，進一步闡明細胞膜藥物轉(zhuǎn)運體、藥物代謝酶等在NC體內(nèi)外毒性中的作用，并進行體內(nèi)外毒性的相關(guān)性分析，為NC的進一步研發(fā)提供參考。
　　第一章有機陽離子轉(zhuǎn)運體1，2與原小檗堿類及類似生物堿相互作用研究
　　背景和目的:原小檗堿類生物堿為叔胺或季銨化合物，在生理pH7.4條件下以陽離子或中性化合物存在。肝臟、腎臟細胞基底膜上的有機陽離子轉(zhuǎn)運體1和2(OCT1和OCT2)主要負責轉(zhuǎn)運小分子有機陽離子及

5、中性化合物?；谠￠迚A類生物堿的化學結(jié)構(gòu)，及OCT1/OCT2的肝腎分布，本章主要研究原小檗堿類及類似物生物堿與OCT1/OCT2的相互作用。
　　方法:應用穩(wěn)定高表達人有機陽離子轉(zhuǎn)運體1或2(hOCT1，hOCT2)和空載體(mock)細胞(MDCK-hOCT1，MDCK-hOCT2和MDCK-mock)模型，采用細胞積聚方法，闡明原小檗堿類及類似生物堿，包括小檗堿、黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗紅堿、氯化兩面針堿、巴馬汀、延

6、胡素甲素、(-)-延胡素乙素((-)-THP)對OCT1/2經(jīng)典底物的抑制作用，進一步考察其在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hOCT1，hOCT2細胞上的積聚與mock細胞上積聚的差異，以闡明其是否為OCTs底物。此外，為闡明OCTs基因多態(tài)性對該類生物堿攝取的影響，本研究選擇小檗堿和黃連堿，考察其在MDCK-OCT1-P341L和MDCK-OCT2-A270S細胞上積聚與表達野生型OCT細胞上積聚的差異。
　　結(jié)果:本研究考察的生物堿均能顯著抑制Mp

7、p+在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT2細胞上的攝取，且抑制作用不亞于陽性抑制劑(OCT1:奎尼丁;OCT2:西咪替丁)。細胞攝取研究表明，小檗堿、黃連堿、藥根堿、表小檗堿、氯化兩面針堿及小檗紅堿在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT2細胞中的積聚明顯高于mock細胞，細胞攝取動力學研究顯示，在MDCK-hOCT1細胞上，上述生物堿Km大小順序為:黃連堿＞藥根堿＞表小檗堿＞小檗堿＞小檗紅堿＞氯化兩面針堿，Vmax依次為:黃連

8、堿＞表小檗堿＞藥根堿＞氯化兩面針堿＞小檗紅堿＞小檗堿，Clint依次為:氯化兩面針堿＞小檗紅堿＞黃連堿＞表小檗堿＞小檗堿＞藥根堿;而在MDCK-hOCT2細胞上，上述生物堿的Km為:小檗紅堿＞表小檗堿＞小檗堿＞氯化兩面針堿＞黃連堿＞藥根堿，Vmax為:氯化兩面針堿＞黃連堿＞小檗紅堿＞小檗堿＞表小檗堿＞藥根堿，Clint依次為:氯化兩面針堿＞黃連堿＞小檗堿＞藥根堿＞小檗紅堿＞表小檗堿。表達OCT1-P341L和OCT2-A270S等位突變

9、基因細胞對小檗堿和黃連堿的親和力（Km減小）增加至野生型細胞的1.8-11.8倍，內(nèi)在清除率(Clint)為野生型細胞的1.3-3.8倍。
　　結(jié)論:小檗堿、黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗紅堿、氯化兩面針堿、巴馬汀、延胡素甲素、(-)-延胡素乙素均為OCT1/2抑制劑;小檗堿、黃連堿、藥根堿、表小檗堿、小檗紅堿和氯化兩面針堿為OCT1和OCT2底物;OCT1和OCT2基因多態(tài)性(OCT1-P341L和OCT2-A270S)使細胞對

10、小檗堿和黃連堿的攝取能力顯著高于野生型細胞。
　　第二章有機陽離子轉(zhuǎn)運體在Nitidine肝細胞積聚及毒性中的作用
　　背景和目的:在進行生物堿與OCT1/2相互作用研究時，我們發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿(nitidine，NC)在OCTs轉(zhuǎn)基因細胞上的毒性明顯高于mock細胞，文獻也報道了NC在體外肝腎細胞上的毒性。鑒于OCTs在肝、腎組織中的分布，本章主要考察OCTs在NC誘發(fā)肝細胞毒性中的作用。除OCT1外，肝組織中也表達OCT

11、3，以及與OCT具有共同底物的多藥毒素外排轉(zhuǎn)運體(multidrug and toxin extrusion1，MATE1)，本研究同時考察OCT3及MATE1與NC的相互作用。
　　方法:以穩(wěn)定表達hOCT3和hMATE1的MDCK細胞(MDCK-hMATE1和MDCK-hOCT3)為模型，考察NC是否為hOCT3或hMATE1的底物，并與OCT1介導的NC細胞攝取能力進行了比較。另以MDCK-hOCT1，MDCK-hOCT3和

12、mock細胞為模型，采用MTT法及檢測細胞培養(yǎng)液中LDH活性的方法，考察hOCT1， hOCT3介導的NC細胞毒性以及(+)/(-)-THP對其細胞毒性的減弱作用，應用大鼠原代肝細胞進行進一步驗證。
　　結(jié)果: NC在MDCK-hOCT3細胞中的積聚明顯高于mock細胞，由hOCT3介導的細胞攝取的動力學參數(shù)Km和Vmax分別為2.49±0.45μmol/L和25.4±1.1pmol/min/mg protein; NC在MDCK

13、-hOCT1/MDCK-hOCT3細胞上的毒性遠遠大于mock細胞，其IC50值分別為0.163±0.027μmol/L和0.522±0.072μmol/L，而在mock細胞上IC50值為17.0±4.2μmol/L。OCT1/3抑制劑(+)/(-)-THP均能顯著降低NC的細胞毒性;經(jīng)0.5μmol/L NC處理，MDCK-hOCT1和MDCK-hOCT3細胞存活率分別降低至空白對照組的17.5±4.7％和55.4±3.8％，50 t

14、mol/L的(+)/(-)-THP使MDCK-hOCT1細胞存活率分別升高至對照組的45.6±1.2％和51.6±12％，使MDCK-hOCT3細胞存活率升高至對照組的89.1±5.3％和86.1±7.0％。在大鼠原代肝細胞模型上也觀察到(+)/(-)-THP對NC誘發(fā)的肝細胞毒性的減弱作用。NC在MDCK-hMATE1細胞上的積聚顯著高于mock細胞，其Km、Vmax及Clint分別為0.897±0.085μmol/L，18.5±1.

15、0 pmol/mg protein/min，為20.6 mL/mg protein/min。然而，MATE1對NC的轉(zhuǎn)運能力(Clint:20.6 mL/mg protein/min)明顯低于OCT1(Clint:311 mL/mg protein/min)。
　　結(jié)論:OCT1，OCT3通過介導NC的細胞攝取，在其致肝細胞毒性中發(fā)揮重要作用;(+)/(-)-THP通過抑制OCT1，OCT3介導的細胞攝取而減弱NC的肝細胞毒性。M

16、ATE1對NC的轉(zhuǎn)運能力低于OCT1，推測肝細胞中由hOCT1和hOCT3介導的NC攝取大于hMATE1介導的外排。
　　第三章 CYP450對Nitidine的代謝解毒作用
　　背景和目的:第二章實驗結(jié)果顯示，NC在大鼠原代肝細胞上的毒性明顯低于穩(wěn)定高表達OCTs的MDCK細胞上的毒性，我們推測原代肝細胞中OCTs表達可能低于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，推測原代肝細胞中P450酶(CYP450)可能介導NC代謝，從而降低NC的細胞毒性。

17、因此，本章研究CYP酶對NC的代謝及在其肝細胞毒性中的作用。
　　方法:應用人肝微粒體代謝酶表征實驗和人重組酶驗證，闡明參與NC肝臟代謝的主要CYP酶亞型;比較NC對MDCK-hOCT1細胞及hOCT1與hCYP3A4雙轉(zhuǎn)細胞(MDCK-hOCT1/hCYP3A4)的毒性差異，以及CYP3A4抑制劑對NC致MDCK-hOCT1/hCYP3A4細胞毒性的影響，闡明CYP酶對NC的代謝解毒作用。
　　結(jié)果:CYP3A4，CYP2

18、C8，CYP2D6和CYP2B6共同參與NC的肝臟代謝。NC(0.25-10μmol/L)對MDCK-hOCT1/hCYP3A4細胞的毒性明顯低于對MDCK-hOCT1細胞的毒性;CYP3A4抑制劑，氟康唑和紅霉素，顯著增強NC在MDCK-hOCT1/hCYP3A4細胞上的毒性，提示CYP3A4通過介導NC代謝而減弱NC的毒性。
　　結(jié)論:肝臟CYP3A4，CYP2C8，CYP2D6和CYP2B6共同參與NC的一相代謝;CYPs，

19、如CYP3A4，可通過介導NC的肝臟代謝而降低其肝細胞毒性。
　　第四章 Nitidine在大鼠體內(nèi)的藥動學和組織分布研究
　　背景和目的:前述研究考察NC在轉(zhuǎn)基因細胞模型及原代肝細胞模型上的攝取及細胞毒性，本章主要考察單次口服和尾靜脈注射后，NC在大鼠體內(nèi)的藥動學過程，并計算其口服生物利用度，以推測口服給予NC后在體內(nèi)是否會引起毒性。同時考察單次及連續(xù)20天靜脈注射NC(5mg/kg)后，其在大鼠體內(nèi)的組織分布，以闡明NC

20、分布的組織特異性及連續(xù)給藥可能由OCTs介導NC細胞攝取發(fā)生的組織蓄積現(xiàn)象，為NC的體內(nèi)毒性提供藥動學依據(jù)。
　　方法:建立快速、準確、靈敏的LC-MS/MS法測定生物樣本中的NC，并將此方法用于測定大鼠口服10 mg/kg或尾靜脈注射2 mg/kgNC后的血漿藥物濃度，計算其口服生物利用度;比較單次靜脈注射5 mg/kg NC與相同劑量連續(xù)給藥20天后相應組織的分布差異。
　　結(jié)果:大鼠口服10 mg/kg NC后，血藥濃

21、度低，其絕對生物利用度僅為4.8％。鑒于口服NC的生物利用度低，本章考察了大鼠單次靜脈注射5 mg/kg NC后的組織分布，結(jié)果顯示，給藥后0.25 h、0.5 h及2h，心臟、肝臟、腎臟、肺及小腸中NC的濃度遠遠高于其在血漿中的濃度，組織與血漿的濃度比值為9.2-2852;以5mg/kg/day的劑量連續(xù)靜注20天，末次給藥后2h，心臟、肝臟、腎臟及小腸中NC的濃度均高于單次給藥后相應組織中的濃度。
　　結(jié)論:NC的口服生物利用

22、度低，推測其口服后產(chǎn)生毒性的可能性較小。單次靜脈注射NC后，心臟、肝臟、腎臟、肺及小腸中NC的濃度高于其在血漿中的濃度。因此，推測大鼠連續(xù)靜注NC，可能會產(chǎn)生組織蓄積而引起一定的毒性。
　　第五章 Nitidine連續(xù)給藥后大鼠體內(nèi)的毒性研究
　　背景和目的:前幾章研究顯示，由于肝臟細胞中OCT1/3介導NC的細胞攝取，導致NC較強的肝細胞毒性。但NC經(jīng)口給藥后絕對生物利用度低，而靜脈注射后組織分布研究表明，NC在不少組織中

23、的濃度顯著高于血漿中濃度，且連續(xù)給藥后，在大鼠肝臟、腎臟及心臟等臟器存在蓄積現(xiàn)象，提示連續(xù)給藥NC在大鼠體內(nèi)可能引起臟器毒性或整體毒性。因此，本章考察大鼠連續(xù)靜脈注射NC后的毒性，為NC的研發(fā)提供參考。
　　方法: Sprague-Dawley大鼠連續(xù)20天靜脈注射5 mg/kg/day NC，觀察其一般活動行為、體重、檢測血清生化指標，組織病理學檢查，綜合評價NC在體內(nèi)的整體毒性。以MDCK-hOCT2和mock細胞為模型，采用

24、MTT法及檢測細胞培養(yǎng)液中LDH活性的方法，對hOCT2介導的NC細胞毒性以及OCT2抑制劑，(+)/(-)-THP和西咪替丁，對其細胞毒性的減弱作用進行考察。
　　結(jié)果: NC可引起大鼠食欲減退，體重減輕，血清LDH值和BUN值明顯升高，分別為給藥前的2.1倍和1.4倍，ALP值顯著降低至給藥前的1/5，且組織病理學檢查觀察到腎小管產(chǎn)生空泡變性，未發(fā)現(xiàn)NC在大鼠體內(nèi)對其它受檢臟器引起毒性。此外，NC在MDCK-hOCT2細胞上的

25、毒性遠遠大于mock細胞，其IC50值分別為0.556±0.083μmol/L及17.0±4.2μmol/L，而OCT2抑制劑(+)/（-）-THP和西咪替丁均能顯著抑制NC的細胞攝取，從而降低其細胞毒性。提示hOCT2在介導NC細胞攝取引起NC腎臟蓄積而致毒性增強中的重要作用。
　　結(jié)論:大鼠連續(xù)靜脈注射NC5 mg/kg/day20天，可能由腎細胞膜上高表達的OCT2介導NC細胞攝取產(chǎn)生腎臟蓄積而引起腎臟損害，但并不能就此排除