柑橘褐斑病和黑腐病病原及內生型鏈孢菌的比較研究.pdf

1、鏈格孢屬(Alternaria)真菌包括腐生菌、內生菌和致病菌，可引起柑橘上4種病害，即柑橘褐斑病(Alternaria brown spot)，粗檸檬葉斑病(Alternaria leaf spot ofrough lemon)，柑橘黑腐病(Alternaria black rot)和墨西哥萊蒙葉片斑點病(manchafoliar of citrus)。本研究收集我國柑橘主產(chǎn)區(qū)黑腐病、褐斑病病原、內生型鏈格孢及癥狀不明菌株共81株，選

2、擇代表菌株從形態(tài)學、生物學特性、交互致病性、ACT合成基因存在與否檢測，及基于內源多聚半乳糖醛酸酶基因(endoPG)和兩個無名基因的DNA序列的系統(tǒng)進化，分析不同癥狀來源菌株間的差異，確定不同病害病原的種屬關系。結果如下:
　　以2個黑腐病菌株，5個褐斑病菌株及2個內生型鏈格孢菌株為代表，在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后逐一觀察和測定各個菌株分生孢子的形態(tài)、大小、分隔類型和分隔數(shù)、分生孢子梗特征、分生孢子鏈長度和鏈的分支數(shù)等，發(fā)現(xiàn)相

3、同癥狀來源菌株間的形態(tài)學變異較大，無法找到相關參數(shù)（指標）將這些菌株根據(jù)病害癥狀劃分分類單元。
　　黑腐病菌株ZJMJR25、褐斑病菌株ZJOGS2和內生型菌株FJGMW7在PDA、PCA和V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結果顯示同一培養(yǎng)基條件下，菌株間的菌絲生長速率和產(chǎn)孢量無明顯差異，但對碳源和氮源利用差異較大。因菌株數(shù)量有限，暫無法確定該差異與病害具有相關性。
　　致病性測定結果顯示，100μl濃度為105個·ml-1的孢子懸浮液涂抹

4、椪柑和甌柑幼葉接種，所有褐斑病菌株均可引起典型的褐斑病癥狀，病情等級多達4-5級。部分黑腐病菌株能引起椪柑(4/39)或甌柑(8/39)幼葉輕微發(fā)病，內生型菌株中部分也可對椪柑(12/20)或甌柑(4/20)葉片致病，病情等級多在3級以下，病斑黑色，無明顯黃色暈圈。相反，200μl相同濃度孢子液注射果實接種，所有菌株均可引起黑腐病。選用引物對ACTT1R2/ACTT1F2和ACTT2R1/ACTT2R1擴增ACT毒素編碼基因ACTT1和

5、ACTT2，所有褐斑病菌株都能分別擴增出約785bp和840bp的目標片段，黑腐病病原和內生型鏈格孢菌則不能，說明后兩者不存在ACT毒素合成基因。
　　選用本研究中的75個國內鏈格孢菌株和國外已報道的24個鏈格孢菌株，以多聚半乳糖醛酸酶基因（endo PG）部分序列、非編碼區(qū)隨機片段OPA1-3和OPA2-1為標記基因分別構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，所有菌株分為6個亞分支，但共屬于4個大類群，中國菌株只存在于“Clade1，3，4”

6、3個類群中，而“Clade2”中不包括本實驗中國內的菌株，為美國所特有。合并3個基因序列后構建的系統(tǒng)進化樹與單基因構樹顯示的各類群在菌株構成上有一定的重合性，但不完全相同。所構建的3棵進化樹均表明，3種癥狀類型鏈格孢菌的群體遺傳變異與菌株致病性分化、地理來源、寄主種類和癥狀類型相關性不顯著。因此我們認為，包括柑橘黑腐病、褐斑病病原菌及內生型鏈格孢菌在內的中國柑橘上小孢子種的鏈格孢菌可能同屬一個復合種，黑腐病和褐斑病菌間的差異表現(xiàn)在寄主范