豬流感H3N2病毒感染早期誘導豬呼吸道產(chǎn)生多種特異性IgA抗體及其分泌規(guī)律研究.pdf

1、豬流感（Swine Influenza, SI）是一種急性、傳染性呼吸道疾病，不僅嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展，還能感染人群，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。該病發(fā)病快，病程短，傳播迅速，且易發(fā)生變異。感染豬可出現(xiàn)食欲下降、發(fā)熱、咳嗽、打噴嚏、流鼻涕、精神萎靡等癥狀。其病原豬流感病毒(Swine Influenza virus，SIV)大部分屬A型流感RNA病毒，其遺傳特性由NA、M、PB、PA、NP、HA和NS8個基因片段決定。H3N2是該病毒

2、常見亞型。目前國內(nèi)外對流感病毒免疫分子的作用和流感疫苗效力的研究多以鼠、雞等小動物作為研究對象，而對豬流感研究較少。近來研究表明豬是人、禽、豬流感病毒共同的易感宿主，是流感病毒基因重排的“混合器”和流感變異毒株產(chǎn)生的“孵化器”。本研究主要從宿主呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)應答豬流感病毒H3N2感染反應方面開展，研究結果可以對豬流感抗體水平監(jiān)測和豬流感防控提供參考價值。實驗通過人工表達豬流感H3N2病毒8個基因片段的融合蛋白，分別以之作為包被抗原建

3、立間接sIgA-ELISA方法，并檢測同種毒株感染不同品種豬群后，呼吸道多種特異性sIgA抗體的分泌規(guī)律。主要分為以下兩個方面:
　　1.豬流感病毒蛋白的表達與鑒定
　　分別擴增豬流感病毒流行毒株A/swine/guangdong/2006(H3N2)的NA、M1、M2、PB1、PA、HA1、NP和NS18個基因片段，雙酶切后分別連接到pET32a(+)和pColdⅠ表達載體上，構建pET32a(+)-M1、pET32a(+

4、)-NS1、pET32a(+)-PB1、 pET32a(+)-NP、pColdI-HA1、pET32a(+)-NA、pET32a(+)-M2和pET32a(+)-PA等8種重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)測序正確后，轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導表達，成功獲得M1、NS1和PB1三種融合蛋白，蛋白分子量分別約為40 kDa、42 kDa和30 kDa。最后，用抗豬流感H3N2病毒陽性豬血清進行Western blot分析，表明融合蛋白具有良好

5、的抗原性。
　　2.攻毒后豬特異性sIgA抗體分泌規(guī)律的研究
　　培養(yǎng)豬流感病毒，收獲病毒并測定TCID50。分別對二元雜交豬與巴馬豬進行豬流感病毒攻毒感染試驗，并在21天內(nèi)不同時間點采集鼻拭子樣品。最后，用三種融合蛋白建立的間接ELISA方法檢測豬鼻腔中蛋白抗原對應的特異性sIgA抗體。結果表明SIV感染后第5日，鼻腔中抗三種蛋白特異性sIgA抗體分泌均出現(xiàn)明顯增加，感染后14日達到高峰，感染后21日開始下降，但抗三種蛋白