短發(fā)夾狀RNA抑制COX-2表達對人肝癌細胞株黏附侵襲力的影響.pdf

1、第一部分短發(fā)夾狀RNA對人肝癌細胞株COX-2的抑制作用 目的：構建針對人COX-2基因的短發(fā)夾狀RNA真核表達載體質粒，觀察shRNA對人肝癌細胞COX-2表達的影響，為探討RNA干擾作用及機制提供實驗基礎。方法設計合成針對COX-2的兩條shRNA模板序列，將其插入含有U6啟動子的pGenesil-1載體中，得到shRNA真核表達載體質粒WBH1和WBH2，并設陰性對照質粒HK。陽離子脂質體介導下轉染人肝癌細胞株HepG2和

2、BEL7402，熒光顯微鏡下觀察轉染率。應用RT-PCR法和Westernblot法分別檢測兩株細胞轉染后24h、48h、72h和96h的COX-2表達變化。 結果：經酶切分析和測序證實COX-2shRNA真核表達載體已成功構建。質粒在HepG2細胞和BEL7402細胞中的轉染率分別為60％，54％。質粒WBH1導入細胞24h、48h、72h和96h后，RT-PCR法檢測COX-2mRNA表達抑制率，上述4個時間點HepG2細胞

3、分別為18.5％，88.6％、52.8％和42.4％(P＜0.01)，BEL7402細胞分別為9％，45.1％、70.1％和56.3％(P＜0.01)。Westernblot法檢測蛋白抑制率，HepG2細胞分別為10.2％、80.5％、45.3％和39.0％(P＜0.01)。BEL7402細胞分別為8.3％、40.2％、66.4％和35.6％(P＜0.01)。HepG2細胞和BEL7402細胞分別以48h和72h抑制效果最強。質粒WBH

4、2對COX-2的表達無影響(P＞0.05)。 結論：針對人COX-2的shRNA真核表達載體能明顯抑制不同肝癌細胞株的COX-2表達，其抑制效果與靶點的選擇有夫。 第二部分COX-2短發(fā)夾狀RNA對人肝癌細胞株HepG2黏附侵襲力的影響 目的：研究針對人COX-2的shRNA真核表達載體對肝癌細胞株HepG2黏附力和侵襲力的影響。 方法：以質粒WBH1和陰性對照質粒HK體外轉染48h后的HepG2細胞為檢

5、測細胞，未轉染細胞作為空白對照。MTT法觀察HepG2細胞與細胞外基質Matrigel黏附性的變化。Transwell小室實驗以穿過人工基底膜的細胞數量評估HepG2細胞體外侵襲力的變化。 結果：轉染WBH1質粒的HepG2細胞與Matrigel的黏附率為(6.0±0.4)％，與空白對照組[(11.4±0.2)％]相比明顯下降(P＜0.01)，抑制率為47.4％。轉染WBH1質粒的細胞穿膜數為(8.25±1.50)，與空白對照組