缺氧誘導因子1α在食管鱗癌發(fā)病機制中的研究.pdf

1、缺氧誘導因子1α在食管鱗癌發(fā)病機制中的研究研究生：施瑞華導師：范欽和南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院研究背景：缺氧誘導因子是一類由異源二聚體組成的轉錄因子，在機體對缺氧適應性調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用。缺氧誘導因子-1(HIF-1)是其亞型之一，缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內，介導缺氧反應基因(HRG)的調控，產(chǎn)生生理效應。缺氧誘導因子-1 α(HIF-1α)為HIF-1的氧調節(jié)亞單位，是其活性調節(jié)中心。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在大多數(shù)惡性腫瘤中存在表

2、達，可通過調節(jié)血管內皮生長因子(VEGF)等表達誘導血管生成，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展。 目的： 1、觀察HIF-1α、VEGF在食管癌患者發(fā)生、發(fā)展不同階段中表達變化及其與微血管密度(MVD)和腫瘤臨床病理特征間的相關性。 2、觀察缺氧狀態(tài)下HIF-1α、VEGF在食管鱗癌細胞系Eca-109中的表達變化。 3、觀察HIF-1 α基因表達調控對食管鱗癌細胞生物學行為的影響。 4、通過裸鼠移植瘤實驗，探

3、討HIF-1α基因表達調控對食管鱗癌生長、侵襲等行為的影響。 方法： 1、采用免疫組化和原位雜交方法檢測42例食管正常上皮、40例食管鱗狀上皮不典型增生和67例食管鱗癌組織中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達，分析在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展不同階段HIF-1α、VEGF表達變化；以CD3 1作為微血管密度(MVD)指標，分析(1)HIF-1α、VEGF表達與MVD的相關性；(2)HIF-1α、VEGF和MVD與腫瘤臨床

4、病理特征的相關性。 2、在正常氧分壓和低氧條件下Eca-109細胞傳代培養(yǎng)，采用RT-PCR和Westem-Blot方法檢測HIF-1α mRNA和蛋白表達變化。 3、利用RNA干擾技術構建重組質粒pGCsi-H1-shHIF轉染Eca-109細胞：(1)通過RT-PCR及Western Blot觀察HIF-1 α基因沉默后Eca-109細胞株中HIF-1α、VEGF、HO-1、MMP-2、PTEN表達；(2)流式細胞儀

5、分析HIF-1α基因沉默后Eca-109細胞生長變化；(3)細胞增殖實驗觀察其增殖活力改變。 4、HIF-1α基因沉默后Eca-109細胞株和普通Eca-109細胞株植入裸鼠體內，對比觀察移植瘤生長情況。 結果： 1、在食管正常鱗狀上皮-不典型增生上皮-鱗癌組織中HIF-lα、VEGF在mRNA和蛋白水平表達呈逐步升高趨勢，MVD值顯著增加，組間差異明顯；鱗癌組織HIF-1α蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關，且

6、HIF-1α、VEGF蛋白表達與MVD值呈正相關；鱗癌中HIF-lα、VEGF蛋白表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期正相關。 2、Eca-109細胞中HIF-1α mRNA水平在缺氧組較正常氧組明顯升高；VEGF mRNA的表達水平與王HIF-1αmRNA表達一致；HIF-1α蛋白水平在缺氧狀態(tài)下與正常氧狀態(tài)下相比無顯著差異。無論在正常氧還是缺氧狀態(tài)下HIF-1α蛋白的表達均存在磷酸化及去磷酸化兩種形式。 3、p

7、GCsi-H1-shHIF成功轉染Eca-109細胞，有效抑制HIF-1 α基因表達并穩(wěn)定傳代；伴隨HIF-1α基因沉默同時出現(xiàn)VEGF、HO-1、MMF-2、PTEN的蛋白表達均下降； HIF-1α基因沉默后Eca-109更多阻滯于G1/GO期，且細胞增殖活力較對照組明顯低下。 4、HIF-1α基因沉默．Eca-109細胞裸鼠移植瘤生長較普通傳代Eca．109細胞移植瘤明顯緩慢，移植瘤中心出現(xiàn)明顯壞死，免疫組化提示移植瘤內HI

8、F-1 α、VEGF、MVD顯著減少。 結論： 1、食管鱗癌發(fā)生過程中HIF-1α、VEGF表達和MVD增加，HIF-1α可能通過誘導vEGF表達、促進腫瘤血管生成而在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；食管鱗癌中HIF-1 α、VEGF高表達，提示兩者有可能成為評價腫瘤惡性程度的指標。 2、缺氧狀態(tài)下HIF-1α在食管鱗癌細胞Eca-109中有過表達，主要表現(xiàn)在轉錄水平，同時伴有VEGF mRNA的表達增加。而缺氧

9、時HIF-1 α蛋白的表達水平雖然有升高，但無統(tǒng)計學意義，HIF-1α蛋白在缺氧狀態(tài)下的調節(jié)機制可能發(fā)生在翻譯后修飾水平。 3、重組質粒pGCsi-H1-shHIF轉染Eca-109細胞后能有效抑制其HIF-1α基因的表達，導致Eca-109細胞增殖活力下降，多被阻滯于G1/GO期，提示HIF-1α可影響腫瘤細胞DNA的復制合成。HIF-1α上游基因PTEN在HIF-1 α基因表達受抑后也出現(xiàn)了一定程度的抑制，這表明在調控通路中