雙鏈DNA芯片的制備及其應用研究.pdf

1、本文以序列特異性的DNA結合蛋白為研究材料，提出了一系列的新型雙鏈DNA芯片，并用于DNA結合蛋白與靶標DNA的相互作用研究。具體內(nèi)容如下： 1.雙鏈DNA芯片的制備提出了三種雙鏈DNA芯片的制備方法。實驗結果中指出：傳統(tǒng)的雙鏈DNA芯片的制備方法，先固定的單鏈DNA分子后，雜交一段短的DNA分子，然后以該片段為引物在片延伸為雙鏈DNA分子，由于在片復性效果不理想，影響了DNA聚合酶的延伸，芯片點陣一致性較差，且信號較弱；而我們

2、提出的三種單分子發(fā)卡結構探針，可以進行自身復性形成延伸引物，探針的復性和空間定位效果好，更有利于研究DNA/蛋白質(zhì)的相互作用。 2.雙鏈DNA芯片的制備條件的優(yōu)化為了能夠更經(jīng)濟有效的制備雙鏈DNA芯片，首先對發(fā)卡結構探針的設計進行了一序列的優(yōu)化，包括發(fā)卡結構探針的旁側序列、loop區(qū)堿基數(shù)以及回文互補堿基數(shù)的設計等。 3.內(nèi)切酶與DNA序列特異性的相互作用研究利用雙鏈DNA芯片同時對2種內(nèi)切酶與固定的雙鏈DNA探針進行了

3、序列特異的酶切反應。同時，我們研究了甲基化修飾的固定化雙鏈DNA探針，對其對應內(nèi)切酶的酶切活性的影響。 4.rhNF-κBp50二聚體與DNA序列特異性的相互作用研究利用方法Ⅱ制備了包含NF-κBp50二聚體蛋白識別的野生型結合位點以及所有可能發(fā)生的單堿基突變的結合位點的雙鏈DNA芯片。 5.rhNF-κBp50二聚體與單堿基錯配DNA的相互作用研究研究DNA結合蛋白與含有不同單堿基錯配的識別位點間的相互作用對于揭示蛋白

4、質(zhì)與DNA靶序列間的序列特異性結合的機理同樣也是非常有價值的。 6.基于雙鏈DNA芯片的NF-κB蛋白標記檢測方法在雙鏈DNA芯片的應用中，主要通過蛋白質(zhì)的直接熒光標記或對應抗體標記的方法進行檢測。 7.不同結構的固定化雙鏈DNA探針核酸雜交性能的比較我們提出了一種雙鏈DNA探針檢測和核酸序列的方法，并比較三種不同結構的固定化探針的核酸雜交能力。 8.固定化的雙鏈DNA探針結構用于單堿基錯配識別通過延長SHP探針

5、的莖干區(qū)序列，我們發(fā)展了一種新的固定化雙鏈DNA探針用以單堿基錯配識別。該探針的具體設計方法為：將SHP探針的莖干區(qū)全部置于雜交區(qū)的內(nèi)部，并將中間堿基設置一個錯配識別位點。在一組正配和錯配探針中，我們將正配堿基內(nèi)部(莖干區(qū))引入一個錯配堿基用以提高正配探針的雜交效率，而錯配探針的堿基不變，即莖干區(qū)仍為正配。通過在不同溫度和Mg2+濃度下的雜交實驗，證明了這種新型的雙鏈DNA探針具有更強的單堿基錯配識別能力。我們相信，這種雙鏈DNA探針同

6、樣也能適用于分子信標的研究和應用。 通過上述實驗研究表明，雙鏈DNA芯片作為一種高通量的研究手段，對于研究DNA/蛋白質(zhì)的相互作用，以及預測DNA結合蛋白潛在的結合位點是非常有幫助的。因而，我們可以預測，雙鏈DNA芯片將在以下兒個方面的具有潛在的應用：(1)在全蛋白質(zhì)組的規(guī)模上對DNA結合蛋白進行探測；(2)在全基因組范圍掃描DNA結合蛋白的不同結合位點；(3)了解DNA/蛋白質(zhì)復合物中不同堿基和氨基酸之間的作用情況；(4)比較