Sub-MICs抗菌劑對(duì)變異鏈球菌生物膜形成能力影響的初步研究.pdf

1、許多研究已經(jīng)證實(shí)抗菌劑在亞最低抑菌濃度（sub-minimalinhibitoryconcentrations,sub-MICs）下能夠抑制細(xì)菌生物膜的形成，然而，sub-MICs抗菌劑抑制生物膜形成的機(jī)制仍不清楚。目前，大部分的研究都集中于研究G-菌，而sub-MICs抗菌劑對(duì)G+菌的調(diào)節(jié)可能更復(fù)雜。變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans,以下簡(jiǎn)稱(chēng)變鏈菌)是一種主要的致齲微生物。本研究測(cè)定了在洗必泰、茶多

2、酚及氟化鈉三種常見(jiàn)抗菌劑1/2MICs濃度下處理后的變鏈菌生長(zhǎng)曲線以及與變鏈菌形成生物膜相關(guān)的基因的相對(duì)表達(dá)量，并利用Bioflux系統(tǒng)形成一定流速狀態(tài)下的生物膜來(lái)觀察在剪切力作用下所形成的生物膜的形態(tài)特點(diǎn)。此外本研究還用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FieldEmissionScanningElectronMicroscopy,FE-SEM）及激光共聚焦顯微鏡（ConfocalLaserScanningMicroscopy,CLSM）對(duì)變鏈菌

3、的形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行了觀察和分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這三種常見(jiàn)的抗菌劑均能夠明顯上調(diào)與變鏈菌生物膜形成相關(guān)的基因表達(dá)，而且經(jīng)過(guò)sub-MICs氟化鈉和洗必泰處理過(guò)的變鏈菌形成了具有大量細(xì)胞外基質(zhì)的致密生物膜。表明sub-MICs的抗菌劑能夠增強(qiáng)變鏈菌生物膜的形成，這可能不利于齲病的控制。
　　本實(shí)驗(yàn)共分為五個(gè)部分
　　第一部分：抗菌劑對(duì)變異鏈球菌最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）測(cè)定
　　將氟化鈉、茶多

4、酚、洗必泰、甲硝唑及青霉素五種抗菌劑粉劑分別按比例溶于無(wú)菌三蒸水中，過(guò)濾消毒。將凍存的變鏈菌菌株UA159復(fù)蘇，用二倍稀釋法測(cè)定這五種抗菌劑對(duì)變鏈菌的MIC，同時(shí)鋪板計(jì)數(shù)確定其MBC。結(jié)果顯示上述五種抗菌劑均對(duì)變鏈菌有一定的抑菌性，除了洗必泰的MIC和MBC一樣外，其余抗菌劑的MBC均比MIC高。
　　第二部分：Sub-MICs抗菌劑對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)曲線的影響
　　將1/2MICs的抗菌劑分別與變鏈菌制成混懸液，37℃恒溫厭

5、氧培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，8，10，12，24，48h取樣，用酶標(biāo)儀測(cè)其OD600值，同時(shí)做活菌計(jì)數(shù)，用這兩組數(shù)據(jù)同時(shí)繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示氟化鈉的抑菌性最強(qiáng)，青霉素和洗必泰次之，甲硝唑和茶多酚的作用最弱，接近對(duì)照組。
　　第三部分：Sub-MICs抗菌劑作用下變異鏈球菌生物膜相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析
　　設(shè)計(jì)用于RT-PCR的引物。將實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別是浮游態(tài)組和生物膜組，將1/2MICs的各抗菌劑分別與變鏈菌一起37

6、℃恒溫厭氧培養(yǎng)，浮游態(tài)組置于試管內(nèi)，生物膜組置于24孔板內(nèi)并在培養(yǎng)液中加入1％的蔗糖，24h后取樣，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR測(cè)定相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示幾乎所有的實(shí)驗(yàn)基因均發(fā)生高表達(dá)。這說(shuō)明sub-MICs的抗菌劑可促進(jìn)生物膜相關(guān)基因的表達(dá)。
　　第四部分：Sub-MICs抗菌劑作用后變異鏈球菌的形態(tài)學(xué)改變的FE-SEM觀察
　　將健康離體牙切成2mm厚釉質(zhì)塊，75％酒精浸泡30min滅菌消毒。將1/2MICs抗菌

7、劑分別與變鏈菌一起置于24孔板中，在培養(yǎng)液中加入1％的蔗糖，同時(shí)置入釉質(zhì)片，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，24h后取出釉質(zhì)塊，通過(guò)洗滌、固定、脫水、干燥以及噴金處理后，在FE-SEM下觀察變鏈菌的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示，比起對(duì)照組，氟化鈉組和洗必泰組的變鏈菌表面的細(xì)胞外基質(zhì)增多，生物膜更致密，孔隙減少；而茶多酚組的變鏈菌表面只能看到堆積的細(xì)菌及極少數(shù)的細(xì)胞外基質(zhì)。提示氟化鈉和洗必泰可能促進(jìn)了變鏈菌生物膜的形成，而茶多酚則可能通過(guò)抑制變鏈菌胞外基質(zhì)的

8、合成，從而抑制了生物膜的形成。
　　第五部分：Sub-MICs抗菌劑作用下變異鏈球菌在Bioflux系統(tǒng)下形成生物膜形態(tài)的CLSM觀察
　　將1/2MIC的氟化鈉、洗必泰及茶多酚分別與一定量的變鏈菌菌懸液混合，并在混懸液中加入1％的蔗糖，然后將其分別置于BioFlux系統(tǒng)中在剪切力下培養(yǎng)15h后形成生物膜，用死/活菌熒光染料染色，CLSM下觀察。結(jié)果顯示對(duì)照組形成的生物膜內(nèi)部有大量的細(xì)胞空腔；而氟化鈉組和洗必泰組形成的生物膜