miR-122調(diào)控小鼠胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、先天性膽道閉鎖、先天性酶缺乏性肝病和急性肝功能衰竭等難治性肝病、終末期肝病為全球醫(yī)療棘手問題，肝細(xì)胞移植(hepatocyte transplantation,HTx)為解決這些問題提供了新的途經(jīng)，有可能與原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)一樣成為上述疾病的可供選擇的替代治療方法。然而，由于肝細(xì)胞來源短缺、增殖困難等方面的限制，HTx的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展仍相當(dāng)緩

2、慢。
　　 人類胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)建系成功無疑為解決細(xì)胞移植供體(種子)來源問題帶來了希望。ESC具有無限的增殖潛能和發(fā)育的全能性，理論上，它可在特定條件下定向分化為成體所有種類的細(xì)胞，從而為細(xì)胞移植提供源源不斷的種子細(xì)胞來源。目前已有不少成功在體外通過自發(fā)分化或者外源性因子的誘導(dǎo)將ESC誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的報道，然而，由于對胚胎發(fā)育過程中基因激活與沉默的機(jī)制以及胚層、組織和細(xì)胞間的信息調(diào)

3、控網(wǎng)絡(luò)所知甚少，我們尚難以全面、有序地掌控ESC定向分化為肝細(xì)胞的進(jìn)程，所獲取的目的細(xì)胞在分化效率、均質(zhì)性等方面離臨床應(yīng)用尚相距甚遠(yuǎn)。
　　 ESC體外分化被認(rèn)為是人體組織細(xì)胞發(fā)育的重演，其中涉及了基因有序地激活與沉默、增強與衰減，而眾多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制精確地控制這一進(jìn)程。microRNA(miRNA)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)機(jī)制，在細(xì)胞生長與分化過程中扮演著極為重要的角色。目前已初步證明，miR-122在肝臟特異性高

4、表達(dá)，并且在調(diào)控肝臟發(fā)育、肝細(xì)胞代謝等方面起著重要作用。
　　 為探索miR-122在ESC分化為肝細(xì)胞過程中的調(diào)控作用與機(jī)制，我們初步進(jìn)行了如下的實驗研究：
　　 1.細(xì)胞因子、丁酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化常規(guī)培養(yǎng)E14小鼠ES細(xì)胞后，繼續(xù)懸滴培養(yǎng)3 d以形成擬胚體，然后轉(zhuǎn)移擬胚體到6孔板中并添加FGF-410ng/ml、HGF20ng/ml、丁酸鈉2.5mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)分化。分化過程中用倒置相差顯微鏡

5、觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；免疫熒光染色觀察肝細(xì)胞特異性標(biāo)志白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)的表達(dá)；RT-PCR檢測肝細(xì)胞特異性標(biāo)志基因ALB、AFP、甲狀腺素運載蛋白(TTR)的mRNA表達(dá)；流式細(xì)胞技術(shù)檢測ALB陽性細(xì)胞比例；尿素合成功能檢測則對其功能進(jìn)行檢驗。結(jié)果顯示：誘導(dǎo)分化過程中ES細(xì)胞逐漸出現(xiàn)肝細(xì)胞樣改變；誘導(dǎo)分化第7d僅檢測到AFP和TTR在mRNA水平的表達(dá)；第14 d檢測到ALB在mRNA水平

6、的表達(dá)；分化14 d時免疫熒光檢測顯示ALB、AFP、CK18均為陽性；流式細(xì)胞技術(shù)檢測ALB陽性細(xì)胞比例約為68.23％；尿素合成功能檢測見培養(yǎng)液內(nèi)尿素氮的逐日升高，顯示分化14d的肝細(xì)胞樣細(xì)胞具有肝細(xì)胞功能。
　　 2.誘導(dǎo)分化過程中miR-122表達(dá)水平的檢測以誘導(dǎo)開始記為0d，分別取0d，3d，6d，9d，12d，15d細(xì)胞約105～106，采用quantitative Real-time PCR技術(shù)檢測miR-122表

7、達(dá)水平，各時間點檢測重復(fù)3次，以均值繪制miR-122的時序表達(dá)曲線，結(jié)果顯示在ESC體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的各個時期miR-122表達(dá)都處于較低水平，但分化第9天細(xì)胞miR-122表達(dá)較前有明顯上調(diào)。
　　 3.miR-122真核表達(dá)載體的構(gòu)建從小鼠基因組DNA擴(kuò)增pre-miR122，克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，測序鑒定，病毒包裝后，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，并通過綠色熒光蛋白進(jìn)行病毒滴度

8、測定。結(jié)果顯示成功構(gòu)建表達(dá)miR-122的慢病毒載體，病毒的滴度為(1～5)×106 IU/mL。
　　 以上結(jié)果明確了細(xì)胞因子、丁酸鈉聯(lián)合可以有效誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并且分化細(xì)胞具有部分肝細(xì)胞功能；體外誘導(dǎo)分化過程中，ESC分化為肝細(xì)胞的各個時期miR-122表達(dá)都處于較低水平，但分化第9天細(xì)胞miR-122表達(dá)較前有明顯上調(diào)，對miR-122表達(dá)載體轉(zhuǎn)染時間點確定具有指導(dǎo)意義；成功構(gòu)建出miR-122慢病毒