microRNA302c在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、背景：腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)患者最主要的替代治療之一。研究表明，隨著腹透管的改良及置管技術(shù)的改進(jìn)，腹膜炎的發(fā)生率顯著下降，但長(zhǎng)期腹膜透析的病人由于腹膜纖維化，會(huì)出現(xiàn)腹膜透析效能的降低，導(dǎo)致超濾衰竭，而逐漸成為了持續(xù)性非臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)患者

2、退出的主要原因[1]。TGF-β介導(dǎo)的腹膜纖維化發(fā)病機(jī)制的研究一直是國(guó)內(nèi)外PD領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。近期研究者發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition.EMT)在TGF-β誘導(dǎo)的腹膜纖維化發(fā)生起關(guān)鍵的作用[2，3]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissue growth factor，CTGF)作為一個(gè)促纖維化因子，參與了腹膜纖維化發(fā)生的病理生理過(guò)程，同時(shí)在纖維化的始動(dòng)過(guò)程

3、EMT的發(fā)生中也起到重要促進(jìn)作用[4-6]，并且有可能成為抗腹膜纖維化治療的新靶點(diǎn)[7]。microRNA(miRNA)是存在于動(dòng)植物基因組中的功能性非編碼RNA，長(zhǎng)約17～29個(gè)核苷酸。目前已鑒定的miRNAs僅占人類(lèi)基因組序列的1％～3％，卻參與1/3基因表達(dá)的調(diào)控，它在生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。最新的研究報(bào)道，miRNAs表達(dá)失調(diào)與許多疾病相關(guān)，且在EMT發(fā)展進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[9]。我們高

4、通道m(xù)iRNA芯片對(duì)PD腹膜流出液腹膜間皮細(xì)胞miRNA表達(dá)進(jìn)行了圖譜分析。發(fā)現(xiàn)與腹透開(kāi)始時(shí)相比，許多個(gè)miRNA表上調(diào)或者下降表達(dá)。其中的microRNA302c是以CTGF為下游靶點(diǎn)。提示CTGF在PD腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)增高可能與microRNA302c表達(dá)異常有關(guān)?；谝陨戏治?，我們認(rèn)為，microRNA302c參與了調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞EMT及纖維化。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：
　　 目的：利用小鼠腹膜EM

5、T模型，探討小鼠腹膜組織EMT過(guò)程中microRNA302c的表達(dá)及其與EMT的關(guān)系。
　　 方法：12周齡ICR雄性小鼠，28-30克。隨機(jī)分為正常對(duì)照組，假手術(shù)(sham)生理鹽水15天組和30天組，模型4.25％PDS15天組和30天組。sham組：腹腔注射1.5ml生理鹽水，每天一次。模型組：腹腔注射1.5ml含4.25％葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)腹透液，每天一次。按分組于第15天和第30天分別處死小鼠。小鼠臟層腹膜用于提取組織蛋白和

6、mRNA，采用Westem-blot、Realtime PCR方法檢測(cè)microRNA302c、zo-1、vimentin、CTGF的表達(dá)。
　　 結(jié)果：⑴前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)：隨腹腔注射透析液時(shí)間延長(zhǎng)，假手術(shù)組腹膜組織zo-1和vimentin蛋白及mRNA表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而模型組zo-1表達(dá)逐漸下降、vimentin表達(dá)逐漸增強(qiáng)。提示小鼠腹膜EMT建模成功，生理鹽水不能誘導(dǎo)腹膜EMT改變。⑵Realtime PCR顯示模型

7、組小鼠腹膜組織microRNA302c表達(dá)隨注射PDS時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。⑶Western Blot及Realtime PCR顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腹膜組織中zo-1蛋白和mRNA水平隨注射PDS時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，vimentin、CTGF蛋白和其mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)。⑷Linear correlation分析顯示，高糖腹膜透析液誘導(dǎo)小鼠腹膜EMT過(guò)程中，正常對(duì)照組和模型組microRNA302c表達(dá)與CTGF mRNA表達(dá)

8、呈負(fù)相關(guān)；microRNA302c表達(dá)與vimentin mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；microRNA302c表達(dá)與zo-1mRNA表達(dá)呈正相關(guān)；CTGF mRNA與vimentin mRNA表達(dá)呈正相關(guān)；CTGFmRNA與zo-1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：在小鼠腹膜EMT模型中，隨EMT進(jìn)展，腹膜組織的microRNA302c表達(dá)顯著降低并與EMT、CTGF呈負(fù)相關(guān)，提示microRNA302c在小鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT過(guò)

9、程中扮演重要角色。
　　 第二部分：
　　 目的：探討microRNA302c在TGF-β1誘導(dǎo)的HPMC EMT中的作用。
　　 方法：用5ng/ml TGF-β1刺激HPMC，通過(guò)Realtime PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞中microRNA302c及zo-1、vimentin的表達(dá)；轉(zhuǎn)染microRNA302c的前體(pre-miR-302c)，再予TGF-β1刺激，通過(guò)Realtime PC

10、R及Western blot檢測(cè)HPMC microRNA302c及zo-1、vimentin的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：⑴1.5ng/ml TGF-β1刺激后，HPMC microRNA302c表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性降低，zo-1mRNA及蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性降低，vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性升高。⑵Realtime PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1組microRNA302c水平明顯下調(diào)，TGF-

11、β1+pre-miR-302c組microRNA302c表達(dá)則較TGF-β1組顯著上調(diào)(p<0.05)，而與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(p>0.05)。⑶Realtime PCR與Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，zo-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而TGF-β1組vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，以上改變?cè)趐re-miR-302c+TGF-β1組均被抑制，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：TGF-

12、β1誘導(dǎo)HPMC EMT；TGF-β1誘導(dǎo)microRNA302c表達(dá)下調(diào)；上調(diào)microRNA302c可逆轉(zhuǎn)HPMC EMT。
　　 第三部分：
　　 目的：探討microRNA302c參與調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的HPMC EMT的可能機(jī)制。
　　 方法：用5ng/ml TGF-β1刺激HPMC，通過(guò)Realtime PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CTGF的表達(dá)；轉(zhuǎn)染microRNA302c的前體(p

13、re-miR-302c)，再予TGF-β1刺激，通過(guò)Realtime PCR及Western blot檢測(cè)HPMC CTGF的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：⑴5ng/ml TGF-β1刺激后，HPMC CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)。⑵Realtime PCR與Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，TGF-β1組CTGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，以上改變?cè)趐re-miR-302c+TGF-β1組被抑