兩株DEN-2 NS1基因部分序列在HUVEC中表達后對其NO分泌及TLR3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響.pdf

1、目的:研究NGC、B株DEN-2NS1基因部分序列在HUVEC中表達后對其一氧化氮(Nirticoxide,NO)分泌及Toll樣受體3(Tolllikereceptor3,TLR3)、磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(Phosphorylationinterferonregulatorfactor3,pIRF3)、干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferonregulatorfactor3,IRF3)信號通路的影響。
　　方法:用脂質(zhì)體Lipo

2、fectamineRNAi-MAX將本課題組構(gòu)建的NGC株、B株重組質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)-N-NS1、pcDNA3.1(+)-B-NS1)轉(zhuǎn)染至HUVEC,瞬時表達24h、72h,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察NGC、B株NS1基因部分序列在HUVEC中的表達;G418(700μg/ml)篩選形成克隆細胞,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞模型(HUVEC/N-NS1s、HUVEC/B-NS1s),RT-PCR及Western-blot鑒定NGC、B株

3、NS1基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中的表達。實驗為三組:未轉(zhuǎn)染HUVEC組、HUVEC/N-NS1s及HUVEC/B-NS1s組,培養(yǎng)各組細胞16h、26h、37h,收集上清,用亞硝酸鹽/硝酸鹽比色反應(yīng)法檢測NO濃度變化情況;用IFN-α(1800μg/ml)預(yù)處理,再用poly(I:C)(90μg/ml)刺激各組細胞,作用時間分別為12h+4h、24h+2h、36h+1h,Western-blot檢測TLR3、pIRF3及胞核內(nèi)IRF3蛋白表達

4、情況。
　　結(jié)果:
　　1.瞬時轉(zhuǎn)染72h,激光共聚焦掃描顯微鏡檢測,B株NS1基因瞬時表達的部分細胞胞漿中可見紅色熒光,確定為瞬時表達NS1蛋白。
　　2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染45d,RT-PCR及Westernblot檢測,確定轉(zhuǎn)染成功,獲得表達NS1基因部分序列細胞株。
　　3.亞硝酸鹽/硝酸鹽比色反應(yīng)法檢測,隨時間延長,各組細胞分泌NO濃度逐漸升高,且HUVEC/B-NS1s組較其它組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

5、5)。
　　4.用IFN-α預(yù)處理各組細胞24h,再用poly(I:C)刺激2h,Westernblot檢測,與HUVEC比較,HUVEC/N-NS1s及HUVEC/B-NS1s組胞核內(nèi)IRF3蛋白表達降低,且HUVEC/B-NS1s組低于HUVEC/N-NS1s組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);此外,HUVEC/N-NS1s組TLR3、pIRF3蛋白表達均高于其它組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而HUVEC/B-NS1

6、s組TLR3、pIRF3蛋白表達低于其它組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立NGC、B株NS1基因部分序列穩(wěn)定表達細胞株。
　　2.用IFN-α(1800μg/ml)預(yù)處理HUVEC24h,再用poly(I:C)(90μg/ml)刺激2h,可增強胞核內(nèi)IRF3蛋白的表達。
　　3.NGC、B株NS1基因部分序列在HUVEC中表達后可能通過TLR3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對下游分子IRF3蛋白表