人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學檢測中的應用研究.pdf

1、腫瘤的早期發(fā)現和診斷對腫瘤的預防和治療至關重要。腫瘤標志物作為腫瘤臨床診斷的常規(guī)手段之一，對腫瘤的早期發(fā)現和療效觀察具有重要意義。隨著ELISA、RT-PCR、FISH、SELDI-TOF、蛋白質組學、組織芯片和基因芯片等生物技術的飛速發(fā)展，使得許多具有應用前景的腫瘤標志物逐一被發(fā)現，但目前仍無任何一種腫瘤標志物可對惡性腫瘤進行準確診斷和預后預測，腫瘤的實驗室診斷尚缺乏高敏感性和高特異性的檢測方法。研究表明，現有腫瘤標志物存在特異性和陽

2、性率低的缺點，不能很好達到腫瘤“早期診斷”這一目的。對腫瘤標志物進行聯合檢測能提高惡性腫瘤診斷的靈敏度及特異度，但仍存在診斷總準確率不高的缺陷。因此，尋找一種新的高敏感、高特異性的腫瘤標志物或建立一種新的腫瘤標志物的聯合檢測方法成為大多數實驗室研究的方向之一。 人脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶(Human apurinic/apyrimidiIuc endonuclease/redoxeffector factor，hAPE1)是DNA

3、損傷堿基切除修復(base excision repair，BER)途徑的關鍵酶，是一種多功能蛋白質，具有修復AP位點和氧化還原雙重功能，與細胞凋亡，腫瘤細胞的增殖、分化和轉化，放化療敏感性以及神經系統(tǒng)退行性變化有著密切的關系。國內外研究表明，hAPE1蛋白在機體各器官組織中均有表達，而腫瘤組織中的hAPE1定位和表達與相應的正常組織有顯著差異，其表達水平與腫瘤放化療抵抗有關。本課題前期研究發(fā)現，腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達顯著高于

4、正常人。因此，hAPE1的表達水平(和/或類型)可作為篩選某些腫瘤的輔助手段，hAPE1有望成為腫瘤早期診斷中一項敏感而特異的指標。我們推測，對hAPEI進行血清學檢測可能有助于惡性腫瘤的早期臨床診斷，并有效判斷腫瘤細胞放療和化療的敏感性。 研究目的： 1.構建hAPE1原核表達載體，誘導表達、純化hAPE1融合蛋白，并對其生物學功能進行初步分析； 2.建立穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備并純化h

5、APE1單克隆抗體，鑒定其生物學特性并進行初步應用； 3.初步應用hAPE1血清學檢測方法探討hAPE1對惡性腫瘤的診斷作用，并與多腫瘤標志物蛋白芯片檢測方法比較，探討hAPEl和多腫瘤標志物蛋白芯片聯合檢測在惡性腫瘤診斷中的臨床意義。 研究內容和方法： 1. hAPE1原核表達載體的構建、融合蛋白的純化及功能鑒定 通過分子克隆技術構建包含hAPE1全長基因序列的pET28a-hAPE1原核表達載體，經測

6、序驗證后，將pET28a-hAPE1重組質粒轉化入E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導表達并鑒定，以His親和層析技術純化蛋白，用Western blot及EMSA實驗分析hAPEl融合蛋白的生物學功能。 2. hAPE1單克隆抗體的制備、生物學特性鑒定及初步應用 以純化的hAPE1融合蛋白為抗原四肢皮下和腹腔注射免疫Balb/c小鼠，應用細胞融合、間接ELISA法篩選和克隆化技術獲得穩(wěn)定分泌hAPEl單克隆抗

7、體的雜交瘤細胞株。以小鼠體內誘生法產生腹水，鑒定單抗亞類后采用Protein G柱對其純化。采用秋水仙素阻抑實驗鑒定單抗的染色體核型，Westem blot和間接ELISA法鑒定單抗特異性、種屬交叉反應、效價和親和力，hAPEl15肽陣列鑒定單抗的抗原表位。將單抗初步應用于免疫印跡、免疫細胞化學、免疫細胞熒光和免疫組織化學試驗等實驗中評價單抗性能。 3.hAPE1雙抗夾心ELISA法在腫瘤血清學檢測中的初步應用 對健康體

8、檢者、良性病變患者、腎癌、前列腺癌和睪丸癌患者的C-12多腫瘤標志物蛋白芯片檢測結果進行回顧性分析，評價蛋白芯片的診斷作用；同時用hAPE1雙抗夾心ELISA法對同批樣本的血清標本進行檢測，統(tǒng)計分析hAPEl的血清含量和診斷評價，并對兩種檢測結果進行比較，評價hAPEl在惡性腫瘤診斷中的意義。 研究結果： 1. hAPE1原核表達載體的構建、融合蛋白的純化及功能鑒定 所構建的pET28-hAPE1重組質粒經雙酶切

9、及DNA測序鑒定表明構建正確。pET28-hAPE1重組質粒在37℃，0.4mmol/L IPTG的誘導條件下可在E.coli BL21(DE3)中高效表達，蛋白含量可達菌體總蛋白量的50％，經SDS-PAGE及Western blot鑒定均在預期位置出現陽性條帶；通過His親和層析純化得到純度90％以上的hAPE1融合蛋白，經SDS-PAGE、Western blot及EMSA鑒定hAPEl融合蛋白具有抗原性、AP位點修復活性和氧化還

10、原活性。 2. hAPE1單克隆抗體的制備、生物學特性鑒定及初步應用 經過4次細胞融合，成功獲得了2株能穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞2-G1和4-F6，并通過抗體純化技術對大量制備的腹水進行濃縮和純化，得到純度90％以上的2-G1 mAb和4-F6 mAb。利用ELISA、Westernblot等方法檢測其效價超過1：107，Ig亞類分別是IgG2b和IgG3，親和常數分別為1.8×10-

11、7和3.4×10-5，能特異性識別hAPE1天然蛋白和融合蛋白，與兔、小鼠、大鼠無種屬交叉反應。2-G1 mAb的抗原表位為構象型表位，可應用于免疫細胞化學、免疫細胞熒光和免疫組織化學等實驗技術中。 3. hAPE1雙抗夾心ELISA法在腫瘤血清學檢測中的初步應用 健康體檢者、良性病變患者、腎癌、前列腺癌和睪丸癌患者血清中hAPE1含量分別為8.97(2.47，13.58) ng/ml、9.54(2,36，14.22)

12、ng/ml、14.98(7.14，45.33) ng/ml、14.29(10.83，33.68) ng/ml和20.74(8.76，58.81) ng/ml，腫瘤患者與健康體檢者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。hAPE1雙抗夾心ELISA法對腎癌、前列腺癌和睪丸癌的診斷陽性率分別為：57.14％、53.33％和66.67％，C-12多腫瘤標志物蛋白芯片對腎癌、前列腺癌和睪丸癌的診斷陽性率分別為：48.65％、80,00％和62.1

13、6％。結果表明，兩種方法對3種腫瘤的診斷陽性率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。除前列腺癌外，hAPE1與蛋白芯片聯合檢測腎癌和睪丸癌可顯著提高診斷陽性率，具有統(tǒng)計學差異( P<0.05)。 結論： 1.成功構建hAPEl原核表達載體pET28a-hAPE1，可在E.coli BL21(DE3)中高效表達，經His親和層析純化得到hAPEl融合蛋白，純度達90％以上，具有抗原性、AP位點修復活性及氧化還原活性。 2.

14、成功獲得2株穩(wěn)定分泌抗hAPEl單克隆抗體的雜交瘤細胞株2-G1和4-F6，并純化獲得2株高純度、高效價、高特異性和較高親和力的hAPEl單克隆抗體2-G1 mAb和4-F6 mAb。其中2-G1 mAb的抗原表位為構象型表位，可用于多種免疫學實驗中，是良好的檢測試劑。 3.腎癌、前列腺癌和睪丸癌的血清hAPEl蛋白水平顯著高于健康體檢者，hAPE1雙抗夾心ELISA法在惡性腫瘤診斷中具有臨床意義，與C-12多腫瘤標志物蛋白芯片