陽離子脂質體運載基因跨膜機制的研究.pdf

1、目的:
　　 基因轉染技術在臨床應用和生物學研究領域都已經(jīng)取得了很大的發(fā)展,但是DNA分子本身不能很好地完成內(nèi)在化過程,因此,這項技術的關鍵在于如何使基因有效地進入細胞。研究發(fā)現(xiàn)載體系統(tǒng)可以高效轉運基因,載體主要包括病毒載體和非病毒載體。由于病毒載體的安全性問題,如誘導免疫反應和感染等限制了它的推廣應用,所以盡管非病毒載體介導的轉染效率與病毒載體系統(tǒng)相比不夠理想,但近年來發(fā)展速度很快。
　　 陽離子脂質體是最主要的非病毒

2、載體之一,它具有可自然降解、免疫原性低、可重復轉染、易于制備等優(yōu)點。然而,由于細胞內(nèi)外所存在的某些獨特的生物學障礙,例如血清中DNA核酸酶的降解和吞噬細胞對部分DNA的清除等,如果不了解其作用機制,就很難獲得思路上的突破,更不能保證體內(nèi)試驗的成功和臨床應用。
　　 在以往的研究中,人們主要關注于細胞對自身體內(nèi)其他物質的攝取,對于細胞膜上物質跨膜運輸?shù)纳飳W研究比較多,但是針對各種藥物例如基因轉染中藥物載體的運輸機制的研究相對較少

3、。本研究旨在將生物學領域細胞膜物質轉運與基因傳遞結合起來,使用不同的抑制劑,抑制細胞膜上的各種攝取路徑,即抑制轉染過程,然后檢測目的基因表達情況,定性以及定量檢測抑制作用對基因轉染效率的影響,以探究轉染過程所涉及的跨膜機制,為更好地了解和克服轉運過程的生物學障礙提供參考。
　　 方法:
　　 利用細胞膜上物質運輸通道的相關抑制劑,在基本不影響細胞活性的條件下,分別針對不同的路徑,抑制細胞對脂質體/DNA復合物的攝取。其中

4、將氯丙嗪、渥曼青霉素作為網(wǎng)格蛋白抑制劑,氯丙嗪可以通過抑制網(wǎng)格蛋白包被小窩在膜上的聚集抑制網(wǎng)格蛋白介導的攝取路徑。渥曼青霉素能夠影響內(nèi)體雙層外殼結構的形成來減少細胞內(nèi)內(nèi)體囊泡,從而抑制攝取過程。高金雀花堿能夠通過調(diào)節(jié)啟動小窩蛋白的信號通路抑制小窩蛋白所介導的攝取路徑,因此將高金雀花堿作為小窩抑制劑。長春花堿能夠影響肌動蛋白骨架正確聚合成肌動蛋白微絲并促進肌動蛋白微絲骨架解離,因此能夠抑制微管微絲介導的攝取路徑。
　　 加入化學抑

5、制劑后,利用膜通道抑制劑干擾細胞對復合物的攝取,然后測定基因轉染的效率。將能夠調(diào)控綠色熒光蛋白的基因轉染到細胞當中,經(jīng)過一段時間的培養(yǎng),在倒置熒光顯微鏡下觀察表達蛋白發(fā)出的綠色熒光強度的變化。而熒光素酶報告基因表達后,在化學底物發(fā)光液的作用下,通過微光檢測儀可以定量檢測不同抑制劑濃度下轉染效率的差異,從而評估這些路徑在復合物內(nèi)在化中的作用。MTT法檢測細胞存活率,并確定能夠使細胞保持較高存活率的抑制劑濃度,從而比較轉染過程對相應路徑的依

6、賴性。
　　 結果:
　　 1.綠色熒光蛋白檢測結果顯示,加入不同濃度的氯丙嗪、渥曼青霉素、高金雀花堿、長春花堿后,隨著抑制劑濃度的增大,綠色熒光信號明顯減弱。同時加入氯丙嗪和高金雀花堿,或渥曼青霉素和高金雀花堿,對比綠色熒光信號,結果發(fā)現(xiàn)同時加入兩種藥物熒光強度減弱程度增大,但是與單獨加入一種藥物相比,不同抑制劑之間差別不大。
　　 2.熒光素酶報告基因轉染結果顯示,加入不同濃度抑制劑后,隨著抑制劑濃度的增加,

7、RUL值均具有不同程度的遞減趨勢。
　　 3.MTT結果顯示,將抑制劑濃度控制在一定范圍內(nèi)時,能夠保證細胞存活率保持在較高水平,使基因轉染檢測結果具有較高的可信度。用熒光素酶RUL值與對應的細胞存活率相比發(fā)現(xiàn),在細胞存活率均衡的情況下,隨著藥物濃度的增大,RUL值仍然保持下降趨勢。
　　 結論:
　　 本研究表明,網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用是本文所用陽離子脂質體運載基因進入細胞的主要途徑,其中微管微絲介導的