OX1R和KOR異源二聚化對細胞內信號轉導途徑的影響.pdf

1、食欲素（Orexin，OX）/食欲素受體（Orexin receptor，OXR）系統(tǒng)和強啡肽/κ型阿片肽受體系統(tǒng)在獎賞通路的調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，與抑郁癥的發(fā)病機制和病理生理過程密切相關。食欲素1型受體(OX1R)和κ型阿片肽受體（KOR）都是G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族A類亞家族的成員。關于二者異源二聚化的研究，到目前為止尚未見報道。本實驗主要觀察OX1R和KOR能否形成異源二聚體以及二聚體形成后對細胞內信號轉導途徑的影響，

2、為進一步分析OX1R和KOR參與的包括抑郁癥在內的多種疾病的作用機制提供實驗依據并為相關疾病的治療提供新的作用靶點。
　　首先利用分子克隆的方法成功構建真核重組質粒EGFP-OX1R。利用激光共聚焦顯微鏡下觀察EGFP-OX1R瞬時轉染HEK293細胞后的表達。然后進行免疫熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察瞬時共轉染OX1R-EGFP和KOR-Myc的HEK293細胞，OX1R和KOR在細胞膜的共定位表達。利用生物共振能量轉移技術

3、（bioluminesence resonance energy transfer，BRET）檢測OX1R和KOR的異源二聚化。最后建立單獨或共表達OX1R和KOR的穩(wěn)轉細胞系，通過雙熒光素酶法檢測在OrexinA或DynA(1-13)處理下HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內的報告基因血清反應元件（SRE）、cAMP反應元件（CRE）、激活T細胞的細胞核因子（NFAT）的表達。Wester

4、n blot法檢測在OrexinA或DynA(1-13)刺激下cAMP反應元件鏈接蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）在HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內的磷酸化活性變化。OrexinA或DynA(1-13)處理 HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞后，檢測細胞內cAMP的變化。Fluo-4

5、NW試劑盒檢測OrexinA或DynA(1-13)誘導HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞質內Ca2+含量的變化。通過對CRE、SRE、NFAT、cAMP和Ca2+在細胞內含量的變化以及對細胞內CREB磷酸化活性的檢測探究OX1R和KOR發(fā)生異源二聚化后對細胞內信號轉導途徑的影響。
　　結果顯示，EGFP-OX1R重組質粒構建正確，并且能夠在細胞膜上正確表達；在激光共聚焦顯微鏡下觀察到O

6、X1R和KOR能夠同時在細胞膜上表達，表明二者存在發(fā)生相互作用的空間基礎；BRET實驗證明OX1R和KOR能夠形成組成型的二聚體，并證明在orexin A和DynA(1-13)的作用下OX1R和KOR之間的親和力增強，OX1R和KOR形成二聚體的能力增加，引起B(yǎng)RET信號的增強；在穩(wěn)轉細胞系HEK293-OX1R、HEK293-KOR和HEK293-OX1R/KOR細胞內瞬時轉染CRE-luc、SRE-luc或NFAT-luc，48小時

7、后在相應激動劑的作用下檢測CRE、SRE或NFAT的表達，結果顯示，與OX1R或KOR單轉細胞相比，OX1R和KOR共轉細胞內CRE的表達增加，而SRE和NFAT的表達降低，說明OX1R和KOR形成二聚體后與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結合減少而與Gαs亞型的G蛋白結合增加；Western blot檢測濃度和時間依賴性CREB磷酸化活性實驗結果表明，與OrexinA刺激的HEK293-OX1R細胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-

8、KOR細胞相比，HEK293-OX1R/KOR細胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，從2.5min到40min，CREB磷酸化均增強，且HEK293-OX1R/KOR細胞內CREB的磷酸化活性在2.5min時達到峰值；濃度依賴的CREB磷酸化檢測結果表明，從10Nm~100nM，OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細胞內CREB的磷酸化活性要比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細

9、胞和DynA(1-13)刺激的HEK293-KOR細胞內的磷酸化活性明顯增加，表明OX1R/KOR二聚化后與Gαs亞型的G蛋白結合增加，增強了細胞內CREB的磷酸化；細胞內鈣離子含量的檢測結果表明，HEK293-OX1R/KOR細胞在OrexinA或DynA(1-13)的作用下，細胞內的鈣離子含量比OrexinA刺激的HEK293-OX1R細胞內的含量降低，進一步表明OX1R/KOR二聚體與Gαq亞型的G蛋白結合降低；同理，在對細胞內c

10、AMP含量的檢測實驗中我們看到OrexinA或DynA(1-13)處理的HEK293-OX1R/KOR細胞內cAMP的含量也明顯比DynA(1-13)處理的HEK293-KOR細胞內的含量增加，表明OX1R/KOR二聚體與Gαi亞型的G蛋白結合降低，與Gαs亞型的G蛋白結合增加。
　　本研究發(fā)現(xiàn)在轉染OX1R和KOR的HEK293細胞內，OX1R和KOR能夠形成穩(wěn)定的異源二聚體，在食欲素或強啡肽作用下OX1R/KOR二聚體改變了原

11、有單體的信號轉導通路，使OX1R/KOR二聚體與Gαi和Gαq亞型的G蛋白結合減少而與Gαs亞型的G蛋白結合增加，細胞內信號轉導通路向AC/PKA發(fā)生偏轉，使細胞內CREB的磷酸化活性增加。CRE B的活性與抑郁癥的發(fā)生密切相關，在抑郁癥的發(fā)病機制和治療的研究中占有重要地位。因此，對OX1R和KOR異源二聚化的研究為深入研究OX1R和KOR與抑郁癥的關系提供了新的實驗依據，為臨床上抑郁癥的治療提供了新的思路，為抗抑郁新藥的研發(fā)提供了新的