杧果小分子熱激蛋白基因的克隆及其逆境脅迫下的功能分析.pdf

1、杧果(Mangifera indica Linn)屬于漆樹科杧果屬常綠植物，是世界上五大熱帶水果之一。近年來由于全球氣候不斷變化，地球溫度不斷升高，導(dǎo)致多種非生物脅迫對杧果的生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響，給杧果產(chǎn)量、品質(zhì)以及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到較大影響。目前，高溫對于杧果果實采后貯藏保鮮的生理生化影響研究較多，但高溫脅迫對杧果幼苗生理生化的影響未見報道，為此，本研究以土杧砧木的一年生盆栽四季杧與臺農(nóng)1號杧品種嫁接苗為材料，進(jìn)行44℃高溫處理，采集處理

2、不同時間的樣品，比較分析這二個品種的生理生化特性。另一方面，本實驗室前期在對杧果在鹽脅迫、干旱等逆境脅迫處理下cDNA差異表達(dá)分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有三個小分子熱激蛋白基因高度表達(dá)響應(yīng)了非生物脅迫，尤其是高溫脅迫的基因片段，為了弄清這3個基因的功能，本研究進(jìn)一步克隆其cDNA全長并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討三個小分子熱激蛋白基因在四季杧中的表達(dá)模式，并將其轉(zhuǎn)化擬南芥和大腸桿菌中進(jìn)行功能分析，為杧果逆境脅迫的深入研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　1.杧果幼苗在高溫脅迫下生理特性的變化
　　在高溫脅迫下，隨著脅迫時間的延長，兩個杧果品種細(xì)胞膜質(zhì)的丙二醛(MDA)和電導(dǎo)率指標(biāo)均出現(xiàn)上升趨勢。四季杧品種的SOD酶活性各個處理時間點均低于對照，臺農(nóng)1號杧的SOD先上升后下降，兩者的CAT酶活性均下降。滲透物質(zhì)的脯氨酸含量先上升后下降，可溶性蛋白、可溶性糖含量均上升，電導(dǎo)率和相對含水量下降。不同品種生理生化指標(biāo)的變化幅度不一致，經(jīng)比較分析推測杧果臺農(nóng)1號杧品種耐熱性比四季杧

4、品種較強(qiáng)。
　　1.MiHSP17.6、MiHSP17.7和MiHSP23.2基因克隆與表達(dá)分析
　　根據(jù)本實驗室前期已獲得的3個小分子熱激蛋白基因cDNA部分序列，采用cDNA全長克隆技術(shù)，利用杧果品種中性狀特別的四季杧不同組織為材料，成功克隆了杧果的三個小分子熱激蛋白MiHSP17.6、MiHSP17.7、MiHSP23.2基因cDNA全長，三個基因序列長度分別為680、720和870 bp，包含完整開放閱讀框分別為46

5、2、465和615 bp，分別編碼144、145和205個氨基酸，推測分子量大小分別為17.6、17.7和23.2 kD，理論等電點分別為5.8、5.7和5.2。經(jīng)Blast比對和蛋白同源性分析，三個蛋白基因均具有小分子熱激蛋白的結(jié)構(gòu)特征，將該3個基因命名分別為MiHSP17.6、MiHSP17.7、MiHSP23.2，Genbank登錄號為KJ459857、KJ459858和KJ459859。通過生物信息學(xué)分析，推測MiHSP17.6

6、與MiHSP17.7均屬于細(xì)胞質(zhì)ClassⅠ家族成員，MiHSP23.2為線粒體家族成員，同源性比較表明，三個小分子熱激蛋白均與可可、棉花、甜橙等植物具有80～82％的相似性。用實時熒光定量PCR技術(shù)分析表達(dá)模式，結(jié)果顯示:三個小分子熱激蛋白基因在葉（嫩葉與老葉）、莖（嫩莖與老莖）、花均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高:在果實形成和發(fā)育初期，MiHSP17.6與MiHSP17.7表達(dá)量略有下降，MiHSP23.2出現(xiàn)上升后下降，但在果實成熟

7、期前，三者的表達(dá)量均明顯上升;在不同逆境脅迫(高溫、低溫、鹽(NaCl)、干旱(PEG)處理和不同的信號物質(zhì)(ABA、H2O2和SA)刺激下，三個基因均被誘導(dǎo)表達(dá)。
　　2.MiHSP17.6與MiHSP17.7原核表達(dá)與功能分析
　　首先獲得了MiHSP17.6與MiHSP17.7兩個基因的融合表達(dá)載體(采用pET-28a)，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，在經(jīng)誘導(dǎo)后獲得大量重組蛋白，之后對其進(jìn)行純化，通過利用SDS

8、-PAGE和Western blot技術(shù)對其進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)果表明上述結(jié)果正確，重組蛋白都可以與抗6-His標(biāo)簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異性的反應(yīng)。pET-HSP17.7與pET-MiHSP17.6兩個大腸桿菌經(jīng)蛋白誘導(dǎo)后，對52℃高溫脅迫均沒有表達(dá)，對4℃與-20℃低溫脅迫耐冷性明顯高于對照。pET-MiHSP17.7蛋白誘導(dǎo)后耐鹽性明顯高于僅轉(zhuǎn)化pET-28a對照，而pET-MiHSP17.6的耐鹽性低于對照。在脅迫初期（2h內(nèi)），兩其

9、的耐旱性均高于對照，但在中、后期兩個蛋白基因的耐旱性明顯低于對照。
　　3.MiHSP17.6、MiHSP17.7和MiHSP23.2真核表達(dá)與功能驗證
　　將MiHSP17.6、MiHSP17.7和MiHSP23.2三個基因片段，分別構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體pB121上，轉(zhuǎn)化擬南芥并用Kan、GUS組織化學(xué)法和PCR篩選，獲得轉(zhuǎn)基因后代MiHSP17.6的5株、MiHSP17.7的35株和MiHSP23.2的5株。將T3代轉(zhuǎn)