阿霉素對p53缺陷細胞MDa-MB-231表達DNA損傷修復相關蛋白的影響.pdf

1、目的：阿霉素是臨床上治療乳腺癌常見的化療藥物，而治療過程中出現的耐藥現象已經成為研究的一個熱點。近年來，人們發(fā)現化療耐藥原因可能與腫瘤細胞DNA損傷修復能力異常增強有關。阿霉素能導致DNA損傷，但其對腫瘤細胞DNA損傷修復相關蛋白表達及功能的影響尚未完全闡明。本實驗主要研究阿霉素對人MDA-MB-231乳腺癌細胞的DNA損傷修復相關蛋白BRCA1、PARP-1和KIF4等蛋白表達及活性的影響，為進一步研究它們在乳腺癌的阿霉素耐藥中作用提

2、供線索。
　　方法：按一定密度接種MDA-MB-231細胞于培養(yǎng)皿中，次日，換新鮮含10％胎牛血清的DMEM2 ml，分別用0、0.05、0.1、0.5、1、2μmol·L-1濃度阿霉素處理MDA-MB-231細胞，24h后裂解細胞，收集蛋白，并進行蛋白定量，Western blot檢測BRCA1、PARP-1和KIF4-的表達及PARP-1的活性。
　　接種MDA-MB-231細胞于培養(yǎng)皿中，次日，換用新鮮的DMEM，以未

3、處理組作為對照組，用0.5、1、1.5、2、2.5、3μmol·L-1濃度阿霉素處理MDA-MB-231細胞1h，用PBS洗細胞兩遍，然后，換用新鮮的DMEM1 ml繼續(xù)培養(yǎng)，20min后裂解細胞，收集蛋白，Western blot檢測BRCA1、PARP-1和KIF4的表達及PARP-1的活性。
　　接種3.5×105個MDA-MB-231細胞于培養(yǎng)皿中，次日，用1μmol·L-1的阿霉素處理MDA-MB-231細胞，未處理組作

4、為對照組，處理24h后用PBS洗細胞兩遍，再換用新鮮含10％胎牛血清的DMEM1 ml分別培養(yǎng)0、20、40、60min，裂解細胞，收集蛋白，Western blot檢測BRCA1、PARP-1和KIF4的表達及PARP-1的活性。
　　按一定密度(3×105)接種MDA-MB-231細胞于培養(yǎng)皿中，次日換新鮮含10％胎牛血清的DMEM2 ml，分別用0、0.05、0.1、0.5、1、2μmol·L-1的阿霉素處理MDA-MB-2

5、31細胞，于37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收取細胞上清液，而細胞用PBS洗滌兩遍，不含EDTA的胰酶消化收集細胞，合并上清液和細胞，再用PBS洗滌兩次，然后用500μl結合緩沖液懸浮細胞，加入5μl的Annevin V-FITC和5μl的PI，避光反應5-15min，流式細胞儀檢測細胞凋亡及存活數量。
　　結果：Western blot檢測不同濃度阿霉素處理MDA-MB-231細胞24h后，結果顯示，0.05、0.1、0.

6、5μmol·L-1濃度阿霉素對PARP-1活性無明顯影響，但1μmol·L-1及以上濃度阿霉素可顯著抑制PARP-1活性；阿霉素對全長PARP-1蛋白水平無明顯影響，但隨著阿霉素濃度的提高，可見少量斷裂的PARP-1蛋白條帶；阿霉素可抑制KIF4表達，并在1μmol·L-1及以上濃度對KIF4抑制非常明顯；在0.05、0.1、0.5、1μmol·L-1濃度阿霉素作用下BRCA1表達明顯增加，在2μmol·L-1濃度阿霉素作用下BRCA1

7、蛋白水平雖然仍高于對照組，但低于0.05、0.1、0.5、1μmol·L-1濃度阿霉素作用組。
　　阿霉素處理MDA-MB-231細胞1 h，恢復20 min后Western blot檢測細胞內蛋白，結果表明，PARP-1活性在0.5、1、1.5、2μmo1·L-1濃度阿霉素作用下呈增強趨勢，但當阿霉素濃度升高到2.5、3μmol·L-1又被抑制；阿霉素短時間(1h)的作用對PARP-1和KIF4表達無明顯影響，PARP-1也不發(fā)

8、生斷裂，而阿霉素作用后BRCA1的表達略有增加。
　　1μmol·L-1濃度阿霉素處理MDA-MB-231細胞24 h，恢復不同時間后Western blot檢測發(fā)現，在阿霉素處理后PARP-1活性被抑制，但給予恢復時間，其活性將逐漸增加；恢復時間對PARP-1全長蛋白水平表達無明顯影響，恢復時間延長，PARP-1蛋白的斷裂有所減少；阿霉素處理給予恢復時間，BRCA1蛋白表達呈現先增加后減少的趨勢，在處理恢復時間0、20和40mi

9、n后，BRCA1表達增強，而在恢復60min后BRCA1表達雖有所減少，但仍高于對照組；阿霉素處理后MDA-MB-231細胞表達KIF4減少，恢復時間越長降低越明顯。
　　不同濃度阿霉素處理MDA-MB-231腫瘤細胞后，用流式細胞儀檢測，低濃度阿霉素可引起腫瘤細胞凋亡，隨著阿霉素濃度的提高，細胞由凋亡逐漸進入死亡，死亡率逐步增加，存活率下降，在1μmol·L-1濃度阿霉素時，細胞凋亡率為9.01％，而細胞存活率減至35.36％，