基因分型技術(shù)在梅花鹿結(jié)核病研究中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核病是一種人畜共患病，我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物--梅花鹿就是它的宿主之一。梅花鹿結(jié)核病病原菌包括牛型分枝桿菌、人型結(jié)核分枝桿菌等等，而這兩種分枝桿菌同為人類(lèi)結(jié)核病的主要病原菌，因此病鹿尤其是開(kāi)放性結(jié)核病鹿可能成為人類(lèi)結(jié)核病主要的傳染源之一，應(yīng)當(dāng)引起人們的高度重視。本文主要應(yīng)用分枝桿菌散在重復(fù)單位(MIRU)和間隔區(qū)寡核苷酸(Spoligotyping)兩種分型方法對(duì)中國(guó)東北部梅花鹿結(jié)核病進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，比較兩種方法應(yīng)用效果的差異，調(diào)查

2、我國(guó)東北部地區(qū)梅花鹿結(jié)核病流行狀況，探討其病原菌的基因型特點(diǎn)。 首先進(jìn)行了結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)和鑒定工作，包括病料的前處理方法的比較、培養(yǎng)基培養(yǎng)效果的對(duì)比，以及結(jié)核桿菌的形態(tài)學(xué)鑒定和PCR鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸處理法較堿處理法陽(yáng)性率高；分離培養(yǎng)采用7H9培養(yǎng)基會(huì)獲得較好的效果，在傳代培養(yǎng)中改良羅氏培養(yǎng)基和丙酮酸鈉培養(yǎng)基效果較好；最后，經(jīng)形態(tài)鑒定和PCR鑒定后，從中國(guó)東北部(吉林、遼寧、黑龍江)三省共分離得到了120株梅花鹿源結(jié)核分枝桿菌

3、臨床分離株，其中人型為92株，牛型為28株。 其次，分枝桿菌散在重復(fù)單位(MIRU)分型技術(shù)在梅花鹿結(jié)核病分子流行病學(xué)研究中的應(yīng)用。提取上述120株分枝桿菌基因組DNA，采用PCR方法擴(kuò)增結(jié)核桿菌基因組中的12個(gè)MIRU位點(diǎn)，計(jì)算每個(gè)菌株不同串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)的拷貝數(shù)，利用Hunter-Gaston指數(shù)(HGDI)評(píng)價(jià)MIRU法的分辨能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MIRU法將120株菌株分為120個(gè)基因型(HGDI=1)，分辨率達(dá)到了100％，高于

4、MIRU分型法對(duì)人源結(jié)核桿菌的分辨率。而MIRU位點(diǎn)多樣性(h)分析結(jié)果顯示：除位點(diǎn)27多態(tài)性最低h=0.0697，幾乎沒(méi)有分辨價(jià)值外，位點(diǎn)4、16、24、26、39、40顯示了高度的多態(tài)性(h≥0.6)，位點(diǎn)2、10、20、23、31顯示了中度多態(tài)性(0.6>h≥0.3)，多態(tài)性均較高，說(shuō)明MIRU分型方法分辨力強(qiáng)，且各地病原菌相關(guān)性較低，幾乎沒(méi)有成簇現(xiàn)象。 間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)(Spoligotyping)在梅花鹿結(jié)核病分

5、子流行病學(xué)研究中的應(yīng)用。擴(kuò)增結(jié)核桿菌基因組中的直接重復(fù)區(qū)(DR區(qū))，利用各自特異的寡核苷酸探針與標(biāo)記后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交確定其基因型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Spoligotyping分型法將菌株分為34個(gè)基因型，其中29種基因型含有1個(gè)菌株，5種基因型含有4個(gè)或4個(gè)以上菌株(H=0.7131)，其分辨率略微低于MIRU分型。 比較上述兩種基因分型方法可見(jiàn)，MIRU分型法顯示了更好的分辨率，同時(shí)，結(jié)合MIRU位點(diǎn)中6個(gè)具有高度多態(tài)性的重復(fù)區(qū)

6、就能夠?qū)γ坊菇Y(jié)核病的病原菌進(jìn)行較好的分辨，將會(huì)進(jìn)一步縮短實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間，使MIRU分型更加快速，簡(jiǎn)潔。而Spoligotyping分型需要設(shè)計(jì)合成43對(duì)探針，相對(duì)于MIRU分型法實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較高，對(duì)于大規(guī)模的結(jié)核桿菌檢測(cè)不夠經(jīng)濟(jì)。因此，在鹿結(jié)核病的分子流行病學(xué)研究中應(yīng)把MIRU分型法作為首選分型法，以Spoligotyping法作為補(bǔ)充。 中國(guó)東北部地區(qū)梅花鹿結(jié)核桿菌的基因型多態(tài)性較高，不同基因型菌株沒(méi)有出現(xiàn)成簇的情況，證明我國(guó)東北