肝癌相關(guān)基因HTA的重組表達及單克隆抗體的制備.pdf

1、目的:本研究將肝癌相關(guān)基因(HTA)進行重組表達并制備抗HTA單克隆抗體,初步分析HTA蛋白功能及其表達譜,為進一步研究其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為肝癌診斷標志和潛在免疫治療靶點的可行性及臨床意義奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:應(yīng)用RT-PCR技術(shù),從人肝癌細胞系HepG2細胞中擴增獲得HTA338-616DNA,將其克隆到原核表達載體pET21a(+)-MBP,IPTG誘導表達MBP-HTA融合蛋白及MBP蛋白,His-tag磁

2、珠純化試劑盒純化兩種蛋白,并用ELISA法進行活性鑒定。分別用MBP、MBP-HTA蛋白刺激并培養(yǎng)HepG2細胞,采用MTT法、平板克隆形成實驗觀察細胞增殖情況,流式細胞術(shù)檢測刺激前后細胞周期分布的改變。用純化的重組蛋白MBP-HTA免疫BALB/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備抗HTA單克隆抗體,并用ELISA和Western blot的方法檢測抗體的靈敏度和特異性,采用免疫組織化學法分析HTA蛋白的表達譜。
　　 結(jié)果:
　

3、　 1.應(yīng)用RT-PCR技術(shù),從人肝癌細胞系HepG2細胞中擴增得到大小約為300bp的HTA338-616DNA片段。通過PCR鑒定、酶切鑒定和DNA測序表明:成功地構(gòu)建了表達MBP-HTA融合蛋白的原核表達質(zhì)粒pET21a(+)-MBP-HTA。
　　 2.通過IPTG誘導,重組MBP-HTA融合蛋白在表達菌E.coli BL21(DE3)內(nèi)得以高效表達,主要以包涵體的形式存在。通過His-tag磁珠純化試劑盒純化和Wes

4、tern blot分析,得到了分子量約為52kDa的目的蛋白。
　　 3.MTT及平板克隆形成實驗顯示:與MBP蛋白刺激后的HepG2細胞及陰性對照組相比,MBP-HTA蛋白刺激后的HepG2細胞增殖明顯;流式細胞術(shù)顯示:MBP-HTA蛋白刺激后的HepG2細胞G1期細胞減少,S期細胞增多,細胞增殖活性增強。
　　 4.制備獲得高效價的特異性抗HTA單克隆抗體。經(jīng)ELISA檢測抗體的效價為1:12800,用Western

5、 blot檢測的效價為1:1600。用免疫組織化學法分析HTA蛋白在不同組織中的表達情況顯示:HTA蛋白在肝癌、肝硬化、肝纖維化、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、宮頸癌、正常肝臟、正常結(jié)腸組織中均有表達,且陽性染色主要見于胞質(zhì)和胞膜,而在其他被檢測組織中尚未觀察到陽性表達,其中在肝癌中陽性表達率較高,明顯高于其在肝硬化、肝纖維化及正常肝組織中的陽性表達率。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建了表達MBP-HTA融合蛋白的原核表

6、達質(zhì)粒pET21a(+)-MBP-HTA,MBP-HTA重組蛋白分子量約52kDa。
　　 2.獲得的重組蛋白MBP-HTA有較強的免疫原性。
　　 3.HTA蛋白可以明顯的促進HepG2細胞增殖,這可能與其促進細胞從G1期過渡到S期有關(guān)。
　　 4.成功制備抗HTA單克隆抗體,該抗體有較高的效價和特異性;能用于免疫組織化學的檢測,且HTA蛋白在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于其在肝硬化、肝纖維化及正常肝組織中的陽