阿托伐他汀抑制TGF-β1誘導(dǎo)的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞成骨樣分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 血管鈣化可發(fā)生在老年，動(dòng)脈粥樣硬化以及代謝性疾病中，例如糖尿病和終末期腎病。TGF-β1能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣化。3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A抑制劑（他汀類藥物）在心血管疾病中發(fā)揮出多方面的益處。β-catenin轉(zhuǎn)移至核內(nèi)參與血管鈣化過(guò)程促進(jìn)特定基因的表達(dá)。自噬作為高度保守的細(xì)胞活動(dòng)通過(guò)溶酶體依賴途徑調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)蛋白更新。然而，目前關(guān)于他汀類藥物通過(guò)自噬和β-catenin信號(hào)通路對(duì)

2、平滑肌細(xì)胞成骨樣分化的影響研究尚少。
　　 有關(guān)血管鈣化的調(diào)節(jié)機(jī)制已有很多理論觀點(diǎn)，但是自噬活動(dòng)在調(diào)控平滑肌細(xì)胞成骨樣分化中的作用和分子機(jī)制研究尚少。有學(xué)者認(rèn)為作為細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制的自噬活動(dòng)可直接促進(jìn)膠原的降解，而膠原也是細(xì)胞成骨樣分化中的標(biāo)志蛋白之一。因此本研究旨在研究阿托伐他汀通過(guò)誘導(dǎo)自噬和影響TGFβ1/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抑制成骨樣分化的相關(guān)作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 本研究從細(xì)胞分子水

3、平，考察TGFβ1對(duì)VSMCs中β-catenin表達(dá)和功能的影響以及對(duì)成骨樣分化標(biāo)志性蛋白表達(dá)的影響;利用蛋白免疫印跡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、小干擾RNA轉(zhuǎn)染以及激光共聚焦技術(shù)探討自噬及β-catenin轉(zhuǎn)錄蛋白在TGFβ1通路誘導(dǎo)成骨樣分化中的作用及信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。而且利用相關(guān)信號(hào)通路抑制劑，自噬抑制劑進(jìn)一步證實(shí)了阿托伐他汀在抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成骨樣分化中的作用機(jī)制。旨在為阿托伐他汀在血管退行性疾病中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，為退行性

4、血管病的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　 結(jié)果:
　　 1、阿托伐他汀抑制TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的成骨樣分化
　　 結(jié)果顯示TGF-β1刺激細(xì)胞6、12、24、48、72小時(shí)，Westernblot結(jié)果證實(shí)TGF-β1可促進(jìn)成骨樣分化標(biāo)志蛋白如Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen)，骨形成蛋白（BMP-2）和骨鈣素(osteocalcin)的蛋白水平表達(dá)增加并呈時(shí)間依賴性。然而，應(yīng)用阿托伐他汀預(yù)處理平滑肌細(xì)胞24小

5、時(shí)后，與單獨(dú)TGF-β1刺激組比較，鈣鹽沉積明顯減少，同樣觀察到在蛋白水平阿托伐他汀可使上述成骨樣分化標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯下降。
　　 2、阿托伐他汀通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制平滑肌細(xì)胞成骨樣分化
　　 2.1、在電鏡下觀察平滑肌細(xì)胞，結(jié)果顯示自噬泡在正常細(xì)胞中較少見。在TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌成骨樣分化的過(guò)程中有少量的自噬泡形成。而當(dāng)采用阿托伐他汀預(yù)處理平滑肌細(xì)胞24小時(shí)繼而應(yīng)用相同濃度TGF-β1，電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自

6、噬泡。應(yīng)用吖啶橙染色觀察自噬泡可以得到相同的結(jié)論。
　　 2.2、Westernblot結(jié)果顯示，阿托伐他汀可使自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和Atg5的表達(dá)增加并呈時(shí)間依賴性。LC3Ⅱ(:)LC3Ⅰ同樣也在阿托伐他汀預(yù)處理后較TGF-β1組明顯升高。
　　 2.3、為了進(jìn)一步明確自噬與成骨樣分化的關(guān)系，利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)在自噬過(guò)程中可抑制自噬泡(AVs)的形成。研究應(yīng)用3-MA后發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制阿托

7、伐他汀誘導(dǎo)的LC3Ⅱ(:)LC3Ⅰ增高，同時(shí)阿托伐他汀發(fā)揮出的抑制成骨樣分化的作用也在應(yīng)用3-MA后被減弱。
　　 3、阿托伐他汀通過(guò)下調(diào)β-catenin表達(dá)誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞自噬
　　 3.1、觀察β-catenin在阿托伐他汀抑制TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞成骨樣分化中的作用。研究中觀察到TGF-β1不僅可以使其經(jīng)典的pSmad2/3發(fā)生核轉(zhuǎn)位，而且可使β-catenin同樣發(fā)生核轉(zhuǎn)位。Westernblot結(jié)果顯示:

8、TGF-β1可使β-catenin呈時(shí)間依賴性的增高。
　　 3.2、研究TGF-βRI及β-catenin在自噬和鈣化的作用，應(yīng)用TGF-βRI激酶抑制劑SD208或者β-catenin抑制劑JW74均明顯加重TGF-β1誘導(dǎo)自噬，但上述二者可減少TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞成骨樣分化。以上結(jié)果說(shuō)明TGF-βRI與β-catenin參與TGF-β1誘導(dǎo)的自噬和鈣化。
　　 3.3、為了進(jìn)一步明確阿托伐他汀誘導(dǎo)的自噬是否

9、依賴于下調(diào)β-catenin水平，采用阿托伐他汀預(yù)處理細(xì)胞，westernblot結(jié)果顯示，阿托伐他汀可明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的β-catenin蛋白水平表達(dá)。為進(jìn)一步明確阿托伐他汀在TGF-β1誘導(dǎo)的自噬和鈣化中的作用。利用重組蛋白Wnt3A過(guò)表達(dá)β-catenin進(jìn)而增加功能性β-catenin水平。研究表明，Wnt3A明顯增加β-catenin表達(dá)，同時(shí)阿托伐他汀誘導(dǎo)的自噬可以被Wnt3A明顯抑制。而阿托伐他汀對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)