熱休克蛋白47在大鼠結膜濾過泡瘢痕化過程中的作用及其作用機制的研究.pdf

1、青光眼濾過術后濾過泡瘢痕化一直是眼科研究的熱點和難點。雖然對其進行了大量的研究,但僅有絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)應用于臨床,然而由于這兩種藥物的嚴重并發(fā)癥而使其臨床應用受到限制。膠原蛋白的異常合成與沉積是纖維化疾病的病理基礎,亦是瘢痕形成的重要原因。熱休克蛋白47(heat shock protein,HSP47)是一種相對分子質量為47000的熱休克蛋白,存在于

2、膠原蛋白分泌細胞的內質網(wǎng)中,與前膠原特異性結合,參與前膠原的折疊、裝配、修飾、轉運等過程,被認為是膠原特異性分子伴侶,為膠原合成所必需。多種纖維化疾病模型和人類纖維化疾病的研究均證實,HSP47的表達上調與膠原合成增加以及纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關。抑制HSP47的表達可以抑制膠原合成,減弱纖維化程度。因此我們假設HSP47有可能成為治療纖維化疾病的有效靶點。
　　 目的:
　　 探討HSP47在大鼠濾過術后濾過泡瘢痕化

3、過程中的作用及其作用機制,以及通過此途徑可能減輕濾過泡瘢痕化的方法。
　　 方法:
　　 1.建立濾過術后結膜濾過泡瘢痕化大鼠模型。
　　 2.應用免疫組織化學染色方法,了解HSP47在大鼠濾過術后濾過泡中的表達情況。
　　 3.應用天狼星紅-苦味酸染色方法,了解Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術后濾過泡中的表達情況。
　　 4.應用實時熒光定量PCR和Westernblot方法,分別檢測HSP47、

4、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術后不同時間點濾過泡中基因轉錄水平和蛋白質水平表達變化的情況。
　　 5.采用抗HSP47單克隆抗體結膜下注射的方法,檢測抑制HSP47蛋白的表達情況,應用實時熒光定量。PCR和Western blot方法,分別檢測Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達的變化。
　　 結果:
　　 1.選用大鼠作為實驗動物,于濾過術中切除全層角鞏膜緣組織,成功建立了濾過術后結膜濾過泡瘢痕化動物模型。
　　 2

5、.HSP47在大鼠濾過術后濾過泡和正常結膜組織均有表達。表達染色的細胞絕大多數(shù)為梭型的成纖維細胞,少數(shù)為血管內皮細胞,定位于細胞漿。濾過術后1w,HSP47蛋白較正常結膜組織明顯增多；濾過術后2w,HSP47蛋白較術后1w有所減少,但是仍然比正常結膜組織表達水平高。
　　 3.應用天狼星紅.苦味酸染色方法可以清晰地顯示Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術后濾過泡的表達情況。濾過術后1w,大鼠濾過泡膠原蛋白較正常結膜組織增多,以Ⅲ型膠原

6、增加為主；濾過術后2w,大鼠濾過泡膠原蛋白較術后1w明顯增加,以Ⅰ型膠原增加為主。
　　 4.大鼠濾過術后濾過泡中HSP47和Ⅲ型膠原在mRNA水平與蛋白質水平的表達均在術后2d就有增加,術后5d、8d、11d時明顯增加,與正常對照組相比均有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05),術后8d均達到峰值,術后11d均下降,但仍高于術后5d的表達水平。在濾過術后2d、5d時,Ⅰ型膠原在mRNA水平與蛋白質水平的表達增加,術后8d、11d時明

7、顯增加,與正常對照組相比有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 5.抗HSP47單克隆抗體結膜下注射1ug后,在蛋白質水平抑制了HSP47的表達,Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在mRNA水平與蛋白質水平的表達均下降,與生理鹽水組相比差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05),與MMC組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 結論:
　　 1.HSP47在大鼠濾過術后濾過泡成纖維細胞和血管內皮細胞的表達較正常結膜組織明顯

8、增高。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過術后濾過泡的表達較正常結膜組織明顯增高。手術創(chuàng)傷可以促使HSP47、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA和蛋白質的表達上調,表明HSP47、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在大鼠濾過泡瘢痕化過程中可能會發(fā)揮重要作用。
　　 2.抑制濾過術后濾過泡中HSP47的表達,可以減少Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原在濾過泡的沉積,從而減輕濾過泡的瘢痕化反應。表明HSP47在大鼠濾過泡瘢痕化過程中通過調控Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達而發(fā)揮作用?？?/p>