農桿菌介導法轉hpalxoo基因棉花再生植株建立及轉hpalxoo基因棉細胞組織抗病表型鑒定.pdf

1、棉花黃、枯萎病是危害棉花維管組織的兩種真菌類病害，在全國棉區(qū)均有分布，它們通過病原真菌堵塞導管、產生毒素等多種形式危害棉株。在棉花生長前期可造成死苗，中后期引起蕾鈴脫落，導致產量、品質嚴重下降。培育和推廣轉基因抗病品種是防治棉花黃、枯萎病簡單易行且行之有效的方法。 Harpin蛋白是由植物病原細菌產生的富含甘氨酸、對熱穩(wěn)定但對蛋白酶K敏感的一類蛋白。它在非寄主植物上能夠引起過敏反應，而且很可能是植物病原細菌的一個重要的致病因子。

2、另外，harpin蛋白還能夠誘導植物產生病蟲抗性以及提高作物的產量與品質。 農桿菌介導法轉hpalxoo基因棉花再生植株的建立。本實驗以中棉所35號為轉化受體品種，采用農桿菌介導法將來自水稻白葉枯病菌(Xanthomonas.oryzae pv.oryzae)的hpalxoo基因全長hpalxoo和其缺失片斷CD轉化棉花莖尖外植體及下胚軸外植體。通過對影響組織培養(yǎng)和轉化的相關因素的研究，建立起了適宜農桿菌介導的莖尖、下胚軸遺傳轉

3、化體系。主要研究結果如下： 建立了以棉花莖尖為受體的轉化體系。通過對影響轉化頻率相關因子的研究，以及對頭孢霉素(Cef)抑菌濃度、卡那霉素(Km)篩選濃度、農桿菌菌株的比較篩選，獲得了hpalxoo的轉化株，PCR擴增到了目的基因，證明了棉花莖尖可做為良好的受體材料并且獲得了根癌農桿菌介導的莖尖轉化體系：未經預培養(yǎng)的帶下胚軸0.5cm的莖尖在OD600=0.3-0.35的根癌農桿菌菌液中浸染15-20min，共培養(yǎng)48-56h；

4、選擇培養(yǎng)以500mg/LCef為抑菌濃度，150mg/LKm為最高篩選濃度；兩種菌株比較結果hpalXOO的侵染轉化率高于CD。 采用農桿菌轉化胚性愈傷，只要選擇的細胞分裂狀態(tài)比較適當，能獲得大量獨立的轉化子，且經過2～4次篩選便可進入分化培養(yǎng)，僅需5～6個月便可獲得再生植株，大大縮短了棉花轉基因周期。本研究依據此方法進行試驗，但是沒有獲得轉基因再生植株，其中諸多影響因素如：基因型、植物激素配比、培養(yǎng)基的選擇、Km選擇壓、農桿菌

5、濃度等。 轉hpalxoo基因棉細胞組織抗病表型鑒定。本實驗還進行了已獲得的轉hpalxoo基因棉懸浮細胞抗病性鑒定及棉花黃萎病菌誘導轉hpalxoo基因棉花產生微過敏防御反應的試驗。主要研究結果如下： 棉花細胞懸浮培養(yǎng)可產生基因型相對一致、快速分裂的細胞群，且容易加入誘導物質，同時還能使病原菌與寄主互作的過敏反應得以簡化。通過棉花懸浮細胞與黃、枯萎菌共培養(yǎng)，分別在3h、6h、9h、12h、24h顯微觀察驗證了棉花懸浮細

6、胞的存活率，導入Harpin蛋白的轉基因棉花T-33、T-34的抗病性較好，在相同條件下與受體中35(Z35)相比死亡率低近10個百分點。 利用針刺葉片接菌法，通過已獲得的轉編碼Harpinxoo的基因hpalxoo的棉花材料、其出發(fā)品種與棉花黃萎病菌互作，采用細胞學染色等方法顯微觀測棉花葉片組織細胞是否會對棉花黃萎病菌產生microHR等細胞學抗病反應表型。實驗結果證明，導入Harpin蛋白的轉基因棉花，氧化帶與傷口間細胞具有