骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)腦缺血皮質(zhì)區(qū)血管新生的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的： 缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)疾病之一，死亡率和致殘率均較高。缺血性腦卒中發(fā)生后，缺血區(qū)神經(jīng)元因缺血、缺氧而發(fā)生死亡，及時(shí)重建缺血區(qū)血運(yùn)是腦缺血損傷治療的關(guān)鍵之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明腦缺血后缺血區(qū)域有代償性血管新生現(xiàn)象，它們對(duì)于增加腦缺血區(qū)血液灌注量和限制缺血半影區(qū)面積的擴(kuò)散有著積極的作用。近年來(lái)，有研究表明通過(guò)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs）

2、可促進(jìn)腦缺血區(qū)的血管新生和受損神經(jīng)功能的恢復(fù)，然而其機(jī)制目前尚不清楚。研究證實(shí)Notch信號(hào)通路在胚胎血管發(fā)育和腫瘤血管新生過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，但Notch信號(hào)通路是否參與腦缺血后血管新生的調(diào)控尚待研究證實(shí)。本課題擬通過(guò)觀察MSCs移植后腦缺血區(qū)血管新生情況及Notch信號(hào)分子在該過(guò)程中的表達(dá)變化，探討Notch信號(hào)通路在MSCs移植后促進(jìn)腦缺血區(qū)血管新生過(guò)程中的作用及調(diào)控機(jī)制，為將來(lái)利用MSCs移植治療缺血性腦卒中的臨床應(yīng)用提供

3、理論依據(jù)。 研究?jī)?nèi)容和方法： 1.采用貼壁法分離、培養(yǎng)、純化SD大鼠MSCs，收集第四代MSCs用于移植實(shí)驗(yàn)。 2.SD大鼠隨機(jī)分為MSCs移植組、缺血對(duì)照組和正常組，前兩組采用線栓法制作大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAo）腦缺血模型，正常組大鼠不予手術(shù)處理。于缺血24小時(shí)后MSCs移植組經(jīng)股靜脈移植MSCs，缺血對(duì)照組則注射等體積的0.01M PBS。在移

4、植后1、3、7、14和21天分批處死各組大鼠，取腦組織標(biāo)本待檢。 3.免疫組織熒光染色后鏡下觀察移植的MSCs在缺血側(cè)和健側(cè)腦組織的分布并計(jì)數(shù)。 4.腦組織標(biāo)本冰凍切片行Ⅷ因子免疫組織化學(xué)熒光染色，×400下計(jì)數(shù)各組腦缺血皮質(zhì)區(qū)微血管數(shù)量。 5.取各組腦組織標(biāo)本冰凍切片行VEGF免疫組織化學(xué)熒光染色，×400下計(jì)數(shù)各組缺血皮質(zhì)區(qū) VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量；RT-PCR方法檢測(cè)各組缺血皮質(zhì)區(qū)VEGF165mRNA的表達(dá)

5、水平。 6.取各組腦組織標(biāo)本冰凍切片行Ⅷ因子和Notch1雙重免疫組織熒光染色，×400下計(jì)數(shù)各組缺血皮質(zhì)區(qū)Notch1表達(dá)陽(yáng)性的微血管數(shù)量。Westernblot方法同時(shí)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組缺血皮質(zhì)區(qū)Notch1蛋白表達(dá)情況。RT-PCR方法則檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組缺血皮質(zhì)區(qū)Notch1mRNA和Hes1mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.培養(yǎng)第四代的MSCs為均一的“紡錘形”，呈漩渦樣生長(zhǎng)，細(xì)胞熒光化學(xué)染色為CD29（+）、CD

6、34（-），符合大鼠MSCs的特征。 2.MSCs移植1天亞組可見(jiàn)移植MSCs主要分布在腦組織缺血側(cè)，缺血側(cè)和健側(cè)腦組織內(nèi)MSCs計(jì)數(shù)分別為7.96±1.28和3.07±0.77，P<0.05，表明MSCs經(jīng)股靜脈移植后可在短時(shí)間內(nèi)遷移到腦缺血區(qū)域。 3.各實(shí)驗(yàn)組1、3、7、14和21天亞組缺血皮質(zhì)區(qū)微血管計(jì)數(shù)：MSCs移植組為3.96±0.33、4.68±0.64、9.26±1.62、8.88±1.34和6.98±1.

7、54；缺血對(duì)照為2.85±0.51、4.47±0.44、5.63±0.69、4.09±0.44和3.75±0.72；正常組為2.79±0.21。雙重?zé)晒馊旧l(fā)現(xiàn)缺血皮質(zhì)區(qū)部分Ⅷ因子陽(yáng)性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CM-DiⅠ，結(jié)果表明MSCs移植可明顯增加腦缺血皮質(zhì)區(qū)新生血管的數(shù)量，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)自于移植的MSCs。 4.各實(shí)驗(yàn)組1、3、7、14和21天亞組缺血皮質(zhì)區(qū)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：MSCs移植組為6.98±0.54、9.15±1.1

8、3、11.14±0.98、9.13±0.35和8.85±0.53；缺血對(duì)照為3.66±0.55、4.62±0.32、5.88±0.62、5.11±0.26和3.99±0.32；正常組為2.46±0.24。RT-PCR結(jié)果示MSCs移植組各時(shí)間點(diǎn)缺血皮質(zhì)區(qū)VEGF165表達(dá)水平明顯高于同時(shí)間點(diǎn)缺血對(duì)照組和正常組（P<0.05），表明MSCs移植可上調(diào)缺血皮質(zhì)區(qū)VEGF蛋白和VEGF165基因的表達(dá)。 5.各實(shí)驗(yàn)組1、3、7、14和

9、21天亞組缺血皮質(zhì)區(qū)Notch1陽(yáng)性表達(dá)微血管計(jì)數(shù)：MSCs移植組為3.30±0.26、3.73±0.25、6.85±0.38、3.78±0.59和0.49±0.25；缺血對(duì)照組為2.57±0.24、1.78±0.28、0.61±0.14、0.05±0.05和0.02±0.02；正常組大腦皮質(zhì)區(qū)無(wú)Notch1陽(yáng)性的微血管。Western blot結(jié)果示MSCs移植組各時(shí)間點(diǎn)缺血皮質(zhì)區(qū)Notch1電泳條帶灰度值均較高于缺血對(duì)照組。RT-P

10、CR結(jié)果則顯示MSCs移植組各時(shí)間點(diǎn)缺血皮質(zhì)區(qū)Notch1、Hes1表達(dá)水平明顯高于缺血對(duì)照組和正常組（P<0.05）。表明MSCs移植能促進(jìn)缺血皮質(zhì)區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞上 Notch1蛋白、Notch1mRNA和Hes1mRNA的表達(dá)。 結(jié)論： 1.MSCs經(jīng)股靜脈注射移植后，可趨向性遷移到腦缺血區(qū)域，并可參與和促進(jìn)缺血區(qū)新生血管的形成。 2.MSCs移植可通過(guò)促進(jìn)缺血皮質(zhì)區(qū)VEGF的表達(dá)，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的Notc