EGF誘導(dǎo)的Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)光學(xué)成像研究.pdf

1、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化對(duì)諸多基本細(xì)胞過程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用,包括細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、增殖等。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)酪氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinases, PTKs)與蛋白質(zhì)酪氨酸磷脂酶(Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs)的相互拮抗,所以一個(gè)特定蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化水平是PTKs和PTPs共同作用的結(jié)果。最近研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化過程受雙氧水(Hydrogen Peroxide, H2O2)介導(dǎo)的氧

2、化還原過程調(diào)節(jié)。證據(jù)顯示H2O2可以通過氧化PTPs活性中心的半胱氨酸殘基而抑制其活性。目前逐漸形成有關(guān)H2O2在生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化信號(hào)中的作用的假說:PTKs的激活不足以提高蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化穩(wěn)態(tài)水平,同時(shí)也需要內(nèi)源性H2O2介導(dǎo)的PTPs抑制作用的參與。雖然H2O2參與酪氨酸磷酸化信號(hào)通路的分子機(jī)制已經(jīng)被廣為接受,但是H2O2是以何種方式調(diào)節(jié)酪氨酸磷酸化信號(hào)動(dòng)力學(xué)過程及其特點(diǎn)仍不清楚,尤其是缺乏活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)信息;

3、此外,在外源性H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中,細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(Glutathione, GSH)氧化還原電勢(shì)與酪氨酸磷酸化動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系至今未見報(bào)道。
　　本研究使用基于熒光蛋白的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)探針Src探針在活細(xì)胞水平對(duì)上表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor, EGF)誘導(dǎo)的和Src激酶介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化過程(簡(jiǎn)稱S

4、rc信號(hào))進(jìn)行了定量研究,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2O2通過抑制PTPs活性,正向地調(diào)節(jié)Src信號(hào)的峰值強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。為了在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)對(duì)Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)與外源性H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞GSH氧化還原電勢(shì)變化動(dòng)力學(xué)進(jìn)行同步研究,我們發(fā)展了基于mVenus/mKOκFRET對(duì)的Src探針和基于單個(gè)熒光蛋白的Grx1-roGFP2探針的雙分子成像方法,在單個(gè)細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)了Src信號(hào)和氧化還原電勢(shì)信號(hào)動(dòng)力學(xué)變化的實(shí)時(shí)同步成像。研究顯示,在外源性H2O2誘導(dǎo)下,

5、細(xì)胞內(nèi)GSH氧化還原體系參與負(fù)調(diào)節(jié)EGF誘導(dǎo)的Src信號(hào)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1)活細(xì)胞內(nèi),在EGF刺激下,利用Src光學(xué)探針,我們得到了Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)曲線與用生化方法得到的EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)信號(hào)動(dòng)力學(xué)曲線類似,通過借鑒用來描述ERK動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型和參數(shù),我們引入三個(gè)簡(jiǎn)化的參數(shù)來定量描述

6、Src信號(hào)動(dòng)力學(xué):信號(hào)峰值、信號(hào)持續(xù)時(shí)間和積分信號(hào)強(qiáng)度。并建立了這三個(gè)參數(shù)與Src活化程度和PTPs活性之間的關(guān)聯(lián)。
　　2)在活細(xì)胞內(nèi),發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2O2通過抑制PTPs活性來調(diào)節(jié)Src的信號(hào)峰值和持續(xù)時(shí)間。通過細(xì)胞內(nèi)表達(dá)H2O2相關(guān)調(diào)節(jié)基因Rac1-N17和Prx1-Y197F,降低內(nèi)源H2O2水平,結(jié)果顯示Src的信號(hào)峰值和持續(xù)時(shí)間均大大降低。而PTPs特異抑制劑vanadate能夠消除此影響。
　　3)結(jié)果提示EGF

7、誘導(dǎo)的內(nèi)源性H2O2必須局部產(chǎn)生,這樣可以避免觸發(fā)細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示這個(gè)防御機(jī)制不利于Src介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化信號(hào)。
　　4)發(fā)展了基于黃色熒光蛋白mVenus和橙色熒光蛋白mKOκ的新FRET對(duì),建立了基于mVenus/mKOκ(簡(jiǎn)稱YO)FRET對(duì)和單熒光蛋白探針Grx1-roGFP2的雙比率實(shí)時(shí)同步成像新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在進(jìn)行多色熒光信號(hào)雙比率實(shí)時(shí)成像時(shí),無需特殊的算法處理,即可獲得雙生物分子信號(hào)互不干擾

8、的動(dòng)態(tài)信息。
　　5)設(shè)計(jì)了基于YO FRET對(duì)的Src激酶探針:YO-Src。在單細(xì)胞內(nèi),對(duì)YO-Src和Grx1-roGFP2探針進(jìn)行同步成像,結(jié)果顯示,外源H2O2對(duì)EGF誘導(dǎo)的Src信號(hào)起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。
　　本論文,以可視化、定量化的實(shí)驗(yàn)方法,在活細(xì)胞水平,顯示了EGF誘導(dǎo)的Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)。闡明了內(nèi)源性和外源性H2O2在Src信號(hào)動(dòng)力學(xué)中的作用特點(diǎn),同時(shí)增進(jìn)了對(duì)信號(hào)分子H2O2在細(xì)胞中重要作用的理解。本論文建立的熒