豚鼠肝外膽道系統(tǒng)運動調控機制及其與膽結石的相關性研究.pdf

1、Cajal間質細胞(interstitialcellsofCajal，ICCs)是西班牙神經解剖學家SantiagoRamonyCajal在1893年應用甲基藍和鍍銀染色，在豚鼠和家兔小腸描述的一種細胞。100多年來，學者們通過對胃腸壁內ICCs的形態(tài)、超微結構、起源以及生理功能等一系列的研究，初步明確ICCs是一種特殊的間質細胞，以細胞網絡的形式分布于整個胃腸道。它能產生自發(fā)性電慢波、參與神經信號的整合與傳遞，對胃腸平滑肌節(jié)律性運動具

2、有重要調控作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，除胃腸道外，其它一些具有自主節(jié)律性的器官或組織，也存在類似ICCs的細胞，稱Cajal樣細胞，受到學者的關注，成為新的研究熱點。 與胃腸平滑肌相似，膽道平滑肌也存在自發(fā)節(jié)律性運動，但其調控機制并不清楚。新近研究表明，人的正常膽囊、膽囊癌組織和壺腹均存在Cajal樣細胞，可能與產生自發(fā)節(jié)律性電活動有關，對膽道系統(tǒng)的運動功能、正常壓力的維持以及防止膽汁返流等具有重要調節(jié)作用，但目前對于Cajal樣細胞在

3、膽道系統(tǒng)的詳細分布、形態(tài)特征、功能以及調控因素研究尚不完全清楚。據(jù)報道一氧化氮(nitricoxide,NO)對胃腸平滑肌的抑制作用是通過調節(jié)ICCs細胞的功能實現(xiàn)的，那么NO對Oddi括約肌運動的抑制作用是否通過Cajal樣細胞介導有必要進一步研究。闡明這一問題，對于深入理解膽道系統(tǒng)運動功能調控機制及其與相關疾病的關系具有重要指導意義。膽結石是膽道系統(tǒng)臨床上常見的疾病之一，目前對于它的病因和發(fā)病機制并不清楚，但多數(shù)研究表明膽囊運動功能

4、減弱在膽石形成過程中起重要作用。鑒于Cajal樣細胞在膽道系統(tǒng)運動調控中的重要性，那么在膽石形成過程中，Cajal樣細胞的分布、形態(tài)功能變化等將是一個非常有趣的問題。 因此，本實驗應用KIT蛋白特異性抗體，進行免疫組化和免疫熒光染色、NADPH-d組織化學方法和肌電活動記錄等技術，結合分層鋪片和冰凍切片，對豚鼠肝外膽道系統(tǒng)包括膽囊、膽囊管、肝總管、膽總管、十二指腸壺腹、Oddi括約肌(sphincterofOddi)等部位Caj

5、al樣細胞的形態(tài)和分布、膽道系統(tǒng)NO神經分布以及與膽結石形成的相關性等，進行較詳細的研究，期望本研究能為深入理解膽道系統(tǒng)自主節(jié)律性運動調控機制以及與膽結石形成的相關性等提供新的實驗依據(jù)。 主要材料和方法： 1.應用KIT蛋白特異性抗體(ACK2)對膽道各部位的全層鋪片或冰凍切片進行免疫組化和免疫熒光染色，顯示Cajal樣細胞的形態(tài)、分布，并對細胞數(shù)量進行計數(shù)和統(tǒng)計學分析比較。 2.采用針刺電極或粘膜接觸電極分別記

6、錄SO、膽總管和膽囊的肌電活動，分別對其頻率和波幅進行統(tǒng)計分析。 3.NADPH-d組織化學與c-kit免疫細胞化學雙重染色顯示NO神經與Cajal樣細胞的相關性。 4.通過喂養(yǎng)致膽石飼料建立豚鼠膽結石模型，比較分析膽道Cajal樣細胞及肌電活動的變化與結石形成的相關性。 主要結果如下： 一、豚鼠肝外膽道系統(tǒng)Cajal樣細胞的形態(tài)和分布 1.全層鋪片和切片均可見Cajal樣細胞存在于整個肝外膽道。

7、在肝管、膽囊管和膽囊，Cajal樣細胞主要位于肌層，細胞呈梭形，有兩個較短突起，無分支。在膽總管的上段，Cajal樣細胞僅見環(huán)行排列，接近中段出現(xiàn)縱行平滑肌的同時，逐漸出現(xiàn)縱行的Cajal樣細胞，分布在環(huán)縱平滑肌之間和肌層內。從膽總管上段至下段，細胞數(shù)量逐漸增多，突起逐漸伸長。肌內的Cajal樣細胞呈長梭行，有兩個突起；而環(huán)縱肌層間的細胞常呈星型，接近壺腹附近的細胞突起相互連接成網絡狀。上述結果表明豚鼠整個膽道系統(tǒng)均存在Cajal樣細胞

8、，為膽道系統(tǒng)自主節(jié)律運動的調控提供了新的形態(tài)學基礎。 2.壺腹部位的膽總管分為外側壁和內側壁，均可見Cajal樣細胞。外側壁的Cajal樣細胞體呈橢圓形或者三角形，突起常有1-3個分支或三個以上，相互連接形成細胞網絡，與十二指腸肌間神經叢周圍ICC相似。在外側壁環(huán)肌的內面Cajal樣細胞與十二指腸深肌叢附近的ICC相似。壺腹內側壁肌層內可見大量的Cajal樣細胞，與平滑肌細胞平行分布。於壺腹開口處，Cajal樣細胞圍繞開口形成一

9、個密集的細胞環(huán)，而緊鄰壺腹開口部位，Cajal樣細胞排列成環(huán)行和縱行。Cajal樣細胞數(shù)量的逐漸增多和形態(tài)的多樣性，提示可能與該部位的復雜生理功能調控有關。 二、豚鼠膽囊、膽總管和Oddi括約肌的肌電活動 1.在壺腹、膽總管和膽囊均可記錄到肌電活動，表現(xiàn)為峰電位活動波，波形有較好的一致性，多為雙向波，且三者峰電位的頻率相同，但波幅以壺腹最大，膽總管次之，膽囊最小。 2.在kreb-ringer液中加入藥物硝普鈉(

10、NO供體)，峰電位活動頻率和波幅顯著降低并迅速消失，提示NO對Cajal樣細胞的活動具有明顯的抑制作用。 三、豚鼠肝外膽道系統(tǒng)Cajal樣細胞與NOS神經分布模式 1.NADPH-d組化染色可見NOS陽性神經分布于整個肝外膽道系統(tǒng)；在肝管、膽囊、膽囊管和膽總管上段，NOS陽性神經纖維較稀疏，散在分布，主要位于肌內；而在膽總管下段和壺腹處，NOS陽性神經纖維較密集，廣泛分于肌間神經叢和肌內，以肌間神經叢最豐富，構成該神經叢

11、的組成部分。 2.NADPH-d組織化學與c-kit免疫細胞化學雙重染色可見NOS神經纖維和Cajal樣細胞在壺腹部位肌間神經叢各自形成獨立的網絡，未見二者有共存現(xiàn)象，但二者間的距離較近，部分膨體樣終術分布在Cajal樣細胞的胞體和突起周圍，可能為NO調控Cajal樣細胞功能的結構基礎。 四、膽結石模型豚鼠Cajal細胞形態(tài)及膽道肌電活動的研究 在膽固醇結石的豚鼠膽囊和膽道系統(tǒng)未見Cajal樣細胞的形態(tài)和數(shù)量有明