采用RNAi抑制CDC25A對照射中CNE-2細胞增殖影響的實驗研究.pdf

1、筆者采用RNAi技術對目的基因CDC25A進行研究，RNAi是新近發(fā)展的一種封閉基因表達的有效方法，獲得2006年諾貝爾生理學獎。它由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默，通過將雙鏈RNA(dsRNlA)導入細胞后，在Dicer酶的作用下產生有活性的小干擾RNA(siRNA)，與該段RNA同源的mRNA產生特異性降解，從而導致特異基因表達抑制的轉錄后基因沉默現象，具有特異性強、抑制效率高，可擴散性、可遺傳性等特點。由于RNAi技術具有獨特的作用機制

2、和簡便的技術流程，因此逐步替代反義核酸技術及基因敲除技術在基因功能研究上的地位。作為腫瘤基因治療研究的新方法，RNAi技術得到了廣泛的應用和迅速的發(fā)展，但在鼻咽癌的放療和加速再增殖機理研究領域中，目前尚無該技術的報道。 【研究目的】 采用RNAi技術沉默鼻咽癌細胞株(CNE-2)CDC25A基因，了解沉默CDC25A基因后鼻咽癌細胞株(CNE-2)在照射中的生長增殖變化情況，初步探討CDC25A表達對鼻咽癌細胞株(CNE

3、-2)照射的影響，以進一步了解鼻咽癌細胞株(CNE-2)照射中加速再增殖發(fā)生的分子生物學機制，從而為鼻咽癌非常規(guī)分割放射治療提供理論依據。 【研究方法】 1.采用RNAi技術構建抑制CDC25A表達的細胞株：通過構建siRNA表達載體，將構建的Psilence4.1-CDC25A載體以陽離子脂質體法轉染入CNE-2中，經過G418毒性實驗篩選、陽性克隆有限稀釋法篩選等方法，培養(yǎng)出能抑制CDC25A表達的CNE-2細胞。

4、 2.逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白印跡法(western blot)在mRNA水平和蛋白水平上驗證所篩選出細胞株的干擾效果，并檢測在照射下細胞株CDC25A的表達變化。 3.四甲基偶氮唑鹽比色法(MTr)及流式細胞術(FAM)檢測在60Co-γ,線，2Gy/d，連續(xù)5天的照射下細胞株的生長增殖變化情況及細胞周期各時相的分布。 【研究結論】 1.成功培育出抑制CDC25A表達的CNE-2細胞株，命

5、名為Psilence4.1-CDC25A細胞，對照株命名為psilence4.1-Control細胞。 2.抑制CDC25A表達后的Psilence4.1-CDC25A細胞無論是在未照射條件下還是在照射條件下，CDC25A的表達都下調，說明對CDC25A干擾的有效性。 3.Psilence4.1-CDC25A細胞在照射下的生長增殖趨勢發(fā)生了改變，生長增殖趨勢變緩，生長增殖高峰延遲，說明抑制CDC25A表達后，鼻咽癌照射加