SiRNA阻斷Ⅲ型PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞的影響.pdf

1、目的:①構(gòu)建靶向阻斷Ⅲμ±型PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)重組質(zhì)粒,包裝重組腺病毒PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD；②研究siRNA阻斷Ⅲ型PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后對(duì)人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響。
　　 方法:①選擇針對(duì)人Ⅲ型PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路mRNA的特異性siRNA靶序列,構(gòu)建靶向PI3KC3基因siRNA干擾的重組質(zhì)粒,并采用基因測(cè)序法以確保siR

2、NA干擾序列已正確插入載體中；將表達(dá)siRNA的穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,利用AdMaxTM腺病毒包裝系統(tǒng)制備重組腺病毒包裝PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD；②PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞,siRNA阻斷Ⅲ型PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后,采用MTT法測(cè)定對(duì)SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)JC-1法檢測(cè)對(duì)SGC7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響,應(yīng)用MDC熒光

3、染色法觀察自噬的發(fā)生,Western blot測(cè)定自噬特異性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3,LC3)表達(dá),計(jì)算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值反映自噬水平。
　　 結(jié)果:①成功構(gòu)建的特異性阻斷Ⅲ型PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的PI3KC3-siRNA質(zhì)粒,經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)siRNA靶序列已正確插入質(zhì)粒載體；包裝的重組腺病毒PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD及對(duì)照腺病毒N

4、C-RNAi-GFP-AD滴度分別為2.0×1011 pfu/L,和1.8×1011 pfu/L；腺病毒對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞感染復(fù)數(shù)(multiple of infection,MOI)為30時(shí)轉(zhuǎn)染效果最好。②PI3K(Ⅲ)-RNAi-AD轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞后胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖明顯受到抑制,實(shí)驗(yàn)組24h、48h、72h的吸光度分別為0.30±2.00％、0.33±1.77％、0.42±2.36％,對(duì)照組24h、48

5、h、72h的吸光度分別為0.40±4.25％、0.58±3.29％、0.85±3.25％(p<0.05),計(jì)算24h、48h、72h抑制率為25.31％±7.30％、43.71％±4.35％、50.89％±2.84％；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組綠色熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞的比值24h、48h、72h分別為19.6％±2.65％、35.7％±6.62％、50.4％±7.39％,對(duì)照組72h為12.3％±2.17％(p<0.05),綠色熒光的細(xì)

6、胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)的比值越大,線粒體膜電位就越低；MDC熒光染色觀察結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組隨著時(shí)間延長(zhǎng)(6h、12h、24h)自噬囊泡逐漸減少,對(duì)照組24h自噬囊泡比實(shí)驗(yàn)組各組都多；LC3的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組6h、12h、24hLC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值分別為0.876±7.51％、0.356±2.99％、0.145±1.98％,而對(duì)照組的24hLC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值為1.267±4.93％(p<0.05)。
　　 結(jié)論:①成功構(gòu)建了特異性阻斷Ⅲ型