TMP1多肽受體篩選及其在腫瘤靶向治療的應(yīng)用.pdf

1、第一部分: 目的：TMP1是利用鞭毛多肽庫篩選得到，該肽能靶向識別惡性腫瘤原位灶、轉(zhuǎn)移灶甚至是微小轉(zhuǎn)移灶，根據(jù)篩選原理TMP1應(yīng)該與腫瘤細胞膜某種蛋白分子結(jié)合，因此本研究目的是篩選出TMP1在細胞表面的受體蛋白；并可能得到新的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白；為解釋TMP1靶向作用、入胞機理和促凋亡作用提供實驗依據(jù)。 方法：借助斑點雜交和Western blot初步證實前列腺癌細胞1E8細胞的某種膜蛋白能與TMP1發(fā)生相互作用；利用pu

2、ll-down(親和層析)方法分離與TMP1相互作用的膜蛋白，質(zhì)譜分析進行混合物的蛋白質(zhì)鑒定與測序，獲得受體蛋白。通過共聚焦免疫熒光、競爭拮抗抑制試驗、流式細胞儀、Western blot和PCR方法進行受體驗證工作。 結(jié)果：Western blot證實TMP1與分子量約為26-28KD的前列腺癌細胞（PC-3M-1E8）蛋白發(fā)生特異性結(jié)合；與TMP1相互的前列腺癌細胞（PC-3M-1E8）膜蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE，改良的藍

3、銀染色方法對蛋白進行染色后，與對照側(cè)相比，實驗側(cè)發(fā)現(xiàn)在分子量約為25-30KD位置出現(xiàn)一特異性的蛋白染色帶。分離該蛋白帶進行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析后，證實該該蛋白為A蛋白（由于保密原因，論文中稱該蛋白為A蛋白）；共聚焦顯微鏡觀察A蛋白在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核均有表達，但以胞漿為主；競爭拮抗抑制試驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的抗A蛋白抗體可以不同程度的抑制TMP1在腫瘤細胞的熒光分布強度，而且呈劑量依賴性；流式細胞儀技術(shù)也發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞預(yù)先用抗A蛋白抗體處理后

4、，可以抑制TMP1對細胞的促凋亡作用。 結(jié)論：A蛋白為TMP1的受體，該蛋白是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白；A蛋白與TMP1相互結(jié)合促進TMP1的入胞作用并發(fā)揮肽的促凋亡作用。 第二部分: 目的：由于TMP1有很靶向于腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的功能，因此本部分是借助TMP1的靶向性，攜帶細胞毒性肽，用于腫瘤的靶向治療。 方法：體外合成TMP1-TAT-NBD，svTMP1-TAT-NBD（變異體），TMP1-NBD，TAT

5、-NBD，TAT，F(xiàn)ITC-TMP1-TAT-NBD，F(xiàn)ITC-svTMP1-TAT-NBD和FITC-TMP1-NBD；細胞免疫熒光分析FITC-TMP1-TAT-NBD，F(xiàn)ITC-svTMP1-TAT-NBD和FITC-TMP1-NBD這三段肽對不同轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細胞（前列腺癌（PC-3M-1E8和PC-3M-2B4）和乳腺癌（（MDA-MB-435S，MDA-MB-231和MCF-7）），耐藥和對化藥物敏感相配對的卵巢癌細胞（OV2

6、008和C13K）以及正常小鼠纖維細胞（NIH/3T3）的親和能力；CCK-8和流式細胞儀方法檢測六種肽對配對細胞的毒性作用以及細胞凋亡的影響；電鏡觀察肽作用下的超微結(jié)構(gòu)的改變；Western blot驗證相關(guān)的肽段對NF-κB，IKB-α和GSK-3β的影響，并運用NF-κB激活－核轉(zhuǎn)運試驗檢測是否發(fā)生NF-κB激活－核轉(zhuǎn)運；動物體內(nèi)成像證實肽是否對腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶具有靶向性識別作用；并用TMP1-TAT-NBD和svTMP1-TAT-

7、NBD進行腫瘤治療試驗。 結(jié)果：體外實驗證明，TMP1-NBD與TMP1相比，對高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞和耐藥細胞株的親和力明顯減弱；TMP1-TAT-NBD對高轉(zhuǎn)移腫瘤細胞則表現(xiàn)比TMP1更高親和性的入胞效應(yīng)，這段肽對高轉(zhuǎn)移腫瘤和耐藥的腫瘤細胞表現(xiàn)為相同的親和力；CCK-8的結(jié)果表明，TMP1-TAT-NBD對腫瘤細胞的毒性最大，TMP1-NBD對細胞的影響與對照肽相似，細胞毒性非常弱；流式細胞儀結(jié)果與CCK-8的結(jié)果表現(xiàn)為一致性，而且

8、對細胞周期有抑制作用，主要阻滯在G1期；光鏡下，TMP1-TAT-NBD致使PC-3M-1E8細胞短時間內(nèi)大量崩解，滿視野為黑褐色的細胞碎屑，超微電鏡證實在腫瘤細胞的胞膜和核膜完全遭到破壞，細胞解體，同時也觀察到，在TMP1-TAT-NBD的作用下，部分細胞胞漿內(nèi)大量的糖原聚集；TMP1-TAT-NBD可以引起細胞核內(nèi)的NF-κB（P65）表達減少，核轉(zhuǎn)運實驗的共聚焦結(jié)果也證實核內(nèi)的活性NF-κB的定位也明顯減少；另一方面，TMP1-T

9、AT-NBD可以引起胞漿內(nèi)GSK-3β和IKB-α的表達下降；在動物體內(nèi)，F(xiàn)ITC-TMP1-TAT-NBD對腫瘤有很好的識別能力，而對正常的器官則沒有向性，F(xiàn)ITC-svTMP1-TAT-NBD對腫瘤無靶向性識別能力；TMP1-TAT-NBD體內(nèi)治療表明，該肽對腫瘤組織有明顯的抑制作用。而svTMP1-TAT-NBD無效應(yīng)。 結(jié)論：TMP1-TAT-NBD對高轉(zhuǎn)移腫瘤和耐藥的腫瘤細胞有高親和力，對低轉(zhuǎn)移細胞、藥物敏感細胞和正常