離子束選育高產(chǎn)L-乳酸菌種及米根霉代謝調(diào)控的研究.pdf

1、本文根據(jù)育種理論和發(fā)酵工程理論，對(duì)L—乳酸生產(chǎn)菌種的選育、發(fā)酵法生產(chǎn)L—乳酸進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。采用離子束誘變育種技術(shù)，以突變株RE3303為出發(fā)菌株，在研究其菌種特性及其發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，獲得耐高溫菌株RF9052，該菌在15％的葡萄糖濃度，40～45℃溫度條件下，36～40h產(chǎn)酸能力達(dá)到133～138g/L;為了更進(jìn)一步降低成本，將碳源由葡萄糖改為玉米粉液化液，再利用離子束誘變育種技術(shù)，并最終篩選到乳酸生產(chǎn)能力和對(duì)糖轉(zhuǎn)化率與原有菌株相

2、比有較大幅度提高的高產(chǎn)菌株RLC41-6，該菌在15％的玉米液化液(以葡萄糖計(jì)算)濃度下，產(chǎn)酸能力達(dá)到138g/L，對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為92％，體積產(chǎn)酸速率達(dá)3.83g/(L·h)。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴介紹了國(guó)內(nèi)外乳酸生產(chǎn)和應(yīng)用狀況及離子束生物工程學(xué)的創(chuàng)立、發(fā)展和最新的研究動(dòng)態(tài)。
　　 ⑵闡述了米根霉PW352和RE3303的發(fā)酵工藝，發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程與產(chǎn)LDH之間的關(guān)系。根據(jù)兩株菌的發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果，選用RE3303作為耐高溫

3、菌以及高產(chǎn)糖化酶和高產(chǎn)L-乳酸菌的出發(fā)菌株。RE3303在40℃，15％的葡萄糖濃度下，產(chǎn)酸90 g/L，45℃產(chǎn)酸73 g/L；以12％玉米液化液(以葡萄糖計(jì)算)為碳源，36℃條件下發(fā)酵，產(chǎn)酸為90～93g/L。
　　 ⑶介紹了離子注入的能量、劑量等對(duì)米根霉存活率及突變率的影響，確定了合適的N+離子誘變參數(shù)：能量10～15keV，劑量40×2.6×1013ions/cm2～60×2.6×1013ions/cm2?？偨Y(jié)了誘變篩選

4、的工藝流程，考察了誘變篩選的方法，經(jīng)過(guò)離子注入處理，篩選到耐高溫菌株RF9052及糖化酶和L-乳酸高產(chǎn)的菌株RLC41-6,都具有很好的遺傳穩(wěn)定性。
　　 ⑷對(duì)菌株RF9052和RLC41-6的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化。確定了其發(fā)酵產(chǎn)酸條件。RF9052在150g/L葡萄糖，(NH4)2SO43.0g/L，MgSO4·7H2O0.075g/L，ZnSO4·7H2O0.2g/L，KH2PO40.3g/L，CaCO370g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基

5、中，接種4mL的培養(yǎng)12小時(shí)的種子液，30mL/250mL裝液量，在40～45℃，200r/min的條件下培養(yǎng)36～40h，產(chǎn)酸可維持與RE3303相當(dāng)?shù)乃?，但最適發(fā)酵的溫度范圍則變?yōu)?6～40℃。RLC41-6在150g/L玉米液化液(以葡萄糖計(jì)算)，(NH4)2SO41.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，ZnSO4·7H2O0.2g/L,KH2PO40.2g/L，CaCO370g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種2mL培養(yǎng)6小時(shí)的

6、種子液，在38℃，30mL/250mL裝液量，200r/min的條件下培養(yǎng)34～36h，產(chǎn)酸可維持在133～138g/L之間，體積產(chǎn)酸速率為3.83g/L·h，較出發(fā)菌株產(chǎn)酸提高了53％。
　　 ⑸對(duì)玉米粉的處理方法做了研究，得出經(jīng)過(guò)液化的培養(yǎng)基有利于發(fā)酵和加速產(chǎn)酸的過(guò)程，不經(jīng)液化的發(fā)酵液粘稠影響氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，產(chǎn)酸慢，即使加入糖化酶與米根霉產(chǎn)生的糖化酶一同水解淀粉分子，也不能明顯地提高產(chǎn)酸速率。
　　 ⑹介紹

7、了發(fā)酵液中的無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，得出合適的無(wú)機(jī)鹽可以抑制雜酸的產(chǎn)生，促進(jìn)乳酸的生成，使生成的乳酸達(dá)到很高的純度。KH2PO4濃度在0.3～0.4％，MgSO4濃度在0.075～0.125％，ZnSO4濃度在0.015～0.02％的范圍內(nèi)，富馬酸等雜酸基本被抑制，發(fā)酵的過(guò)程沿著產(chǎn)L-乳酸的方向。
　　 ⑺通過(guò)對(duì)PW352，RE3303，RF9052，RLC41-6四株菌產(chǎn)酸過(guò)程與分泌乳酸脫氫酶過(guò)程關(guān)系的研究，得出在離子束誘

8、變米根霉篩選高產(chǎn)L-乳酸菌種的過(guò)程中，LDH活性與L-乳酸的生成成正相關(guān)性。經(jīng)離子束修飾的米根霉菌株RE3303，RF9052，RLC41-6，與原始出發(fā)菌株相比，生成乳酸的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)——丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)以及關(guān)鍵酶——乳酸脫氫酶發(fā)生了變化。從LDH對(duì)底物Km值的變化，說(shuō)明由于離子束的修飾作用，使得修飾后的菌株對(duì)輔酶NADH的依賴性降低，而對(duì)底物丙酮酸的親和力增加，這與被離子束修飾后的菌株產(chǎn)酸能力增強(qiáng)的結(jié)果是一致的。從LDH同工酶的變化來(lái)看，