鴨圓環(huán)病毒在人工感染雛鴨體內(nèi)的侵染分布、組織病理學(xué)觀察及其致凋亡作用的研究.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus， DuCV)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的鴨病毒，DuCV感染后可造成鴨生長(zhǎng)遲緩，體重下降等癥狀。迄今為止，對(duì)DuCV的致病機(jī)制仍不完全清楚，圓環(huán)病毒感染通常與淋巴組織損傷有關(guān)，并且可以引起宿主淋巴細(xì)胞凋亡。因此，研究鴨圓環(huán)病毒在人工感染雛鴨體內(nèi)的侵染分布、組織病理學(xué)觀察及其致凋亡作用對(duì)DuCV致病機(jī)制探討具有十分重要的科學(xué)意義。
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鴨圓環(huán)病毒方法的建立及半數(shù)感染量的確定

2、
　　為定量檢測(cè)DuCV在感染鴨體內(nèi)侵染分布的研究，根據(jù)NCBI最新公布的所有DuCV序列，比對(duì)找出保守區(qū)并設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建包含rep目的基因片段的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，成功建立特異、敏感的檢測(cè)DuCV-rep基因的qPCR方法。該建立的qPCR法檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌、致病性大腸桿菌等的基因組模板均無交叉反應(yīng)，對(duì)DuCV特異性反應(yīng)良好，并且最高檢測(cè)靈敏度達(dá)9.23×101 copies/μL，每個(gè)梯度之間Cq值標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)在0.16-0.30

3、之間，變異系數(shù)(CV)在0.79-1.64之間，重復(fù)性良好。此外，通過制備DuCV陽性病料懸液，并對(duì)病懸液進(jìn)行病毒的絕對(duì)定量，然后用不同病毒拷貝數(shù)稀釋度的病懸液人工感染3周齡雛鴨，根據(jù)Reed-Muench法算出半數(shù)感染量為6.57×102.68copies/mL。
　　2.熒光定量分析鴨圓環(huán)病毒在人工感染雛鴨體內(nèi)的侵染分布及組織病理學(xué)觀察的研究
　　為定量分析DuCV在人工感染雛鴨體內(nèi)的侵染分布以及觀察DuCV對(duì)組織的病理

4、損傷，本研究通過DuCV人工感染3周齡雛鴨后，對(duì)胸腺、脾臟、法氏囊、肝臟、腎臟進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，并通過已建立的檢測(cè)DuCV的qPCR方法，定量檢測(cè)病毒在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊等17個(gè)組織器官的動(dòng)態(tài)變化。組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，人工感染DuCV后，胸腺、脾臟、法氏囊、肝臟、腎臟均出現(xiàn)不同程度的病理損傷，主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管充血、出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn);淋巴細(xì)胞稀疏，細(xì)胞間隙增寬;巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);淋巴細(xì)胞發(fā)生核濃縮、核碎裂;出現(xiàn)空泡變性等

5、。qPCR結(jié)果顯示，攻毒后8d在免疫器官感、消化器官、消化道、呼吸道（除肺臟以外）及其他組織器官中均可檢測(cè)到DuCV;其中免疫器官病毒拷貝數(shù)在103.5 copies-104.5 copies，消化器官病毒拷貝數(shù)在103.9 copies-1046 copies，消化道病毒拷貝數(shù)在102.8 copies-104.7 copies，呼吸道病毒拷貝數(shù)在102.8 copies-104.1 copies，其他組織器官（心臟、腎臟、大腦）病毒

6、拷貝數(shù)在102.6 copies-104.9 copies。
　　3.人工感染鴨圓環(huán)病毒致雛鴨免疫器官細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)研究
　　本研究利用免疫組化技術(shù)和DNA末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(Terrminal-deoxynucleotidyTransferase-mediated Nick-end Labeling，TUNEL)對(duì)感染鴨的法氏囊、哈德氏腺、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟分別進(jìn)行了病毒的抗原定位、定量以及細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。免疫組化結(jié)果

7、顯示，在攻毒后8d-48d免疫組化檢測(cè)法氏囊、哈德氏腺、胸腺、脾臟、肝臟和腎臟中病毒含量，平均光密度值在0.0259±0.0148至0.1681±0.0271，隨后病毒含量顯著降低(P＜0.01)，平均光密度值在0.001±0.0002至0.0614±0.0035，說明在攻毒后8d-48d期間，病毒的復(fù)制比較活躍。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，在整個(gè)感染過程中攻毒組細(xì)胞凋亡反應(yīng)顯著(P＜0.01)高于對(duì)照組。結(jié)合細(xì)胞凋亡與免疫組化結(jié)果，并不能明