點(diǎn)突變的雞Ii基因和Ii-新城疫病毒融合基因表達(dá)特性研究.pdf

1、Ii鏈?zhǔn)且环N非多態(tài)性的Ⅱ型跨膜蛋白,其中一個(gè)重要功能是確保新合成的MHC Ⅱ分子的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。MHCⅡ-Ii復(fù)合體的內(nèi)體分選信號(hào)已被證明為Ii鏈胞漿尾部的兩個(gè)獨(dú)立的亮氨酸基元,即Leu 7/Ile8和Pro15/Met16/Leu17。雞Ii鏈胞漿尾部含有Leu8/Ile9和Val17/Leu18兩個(gè)基元,但基元周?chē)被崾欠駥?duì)內(nèi)體定位功能發(fā)揮作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用大引物PCR定點(diǎn)突變法,將雞Ii鏈胞漿尾部?jī)蓚€(gè)基元及其基元周?chē)被岱?/p>

2、別突變?yōu)楸彼?Ala),然后連接到pEGFP-C1載體中,構(gòu)建一系列突變體。利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,將突變體轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察GFP-Ii融合蛋白的定位情況。結(jié)果顯示,兩個(gè)基元可以獨(dú)立調(diào)控Ii分子的內(nèi)化；突變Glu3、Glu4、Gln5、Ile9、Ser10、Ser15、Gly16、Val17或Pro19時(shí),融合蛋白均定位于細(xì)胞漿,Ii分子內(nèi)化功能喪失；而突變Arg6、Asp

3、7、Ser11、Asp12、Gly13或Ser14時(shí),融合蛋白均定位于細(xì)胞內(nèi)體,Ii分子內(nèi)化功能保持。結(jié)果表明,雞Ii鏈胞漿尾部?jī)蓚€(gè)亮氨基酸基元具有獨(dú)立地內(nèi)體定位信號(hào)功能,同時(shí),兩個(gè)基元功能的正確發(fā)揮需要周?chē)被崽囟ǖ目臻g結(jié)構(gòu)支持。 各類(lèi)動(dòng)物Ii鏈的跨膜區(qū)是進(jìn)化中最保守的部分。研究發(fā)現(xiàn),跨膜區(qū)在Ii分子自身聚合成三聚體中發(fā)揮重要的作用,在缺乏胞外區(qū)的情況下,跨膜區(qū)可以使Ii有效聚合成三聚體狀態(tài)。已證實(shí)人Ii鏈跨膜區(qū)Gln47,

4、Thr49和Thr50三個(gè)氨基酸對(duì)MHCⅡ-Ii復(fù)合物的形成是必須的。本文應(yīng)用大引物PCR突變法,將雞Ii基因的Gln47和Thr50氨基酸突變,構(gòu)建了C1-Q47A和C1-Tr50A重組質(zhì)粒。同時(shí),MHCⅡ分子的α鏈和β鏈被亞克隆到pEGFP-N1載體,構(gòu)建了GFP-α、GFP-β重組質(zhì)粒。將C1-Q47A或C1-T50A和GFP-α、GFP-β共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,利用Western blot和免疫共沉淀對(duì)雞Ii鏈跨膜的功能進(jìn)行初步

5、探討。結(jié)果表明,突變Ii鏈跨膜區(qū)Gln47或Thr50氨基酸后,MHCⅡ-Ii復(fù)合物的形成受限。 Ii鏈可以應(yīng)用于構(gòu)建Ii.抗原表位嵌合體。一些研究者用Ii鏈序列作為基本的框架,將CLIP區(qū)用CD4+T細(xì)胞抗原表位基因序列替代,將該嵌合基因插入真核表達(dá)載體,構(gòu)建的嵌合體中的抗原表位能夠有效地呈遞給T細(xì)胞。關(guān)于雞Ii分子CLIP替代的DNA疫苗目前沒(méi)有研究報(bào)道,本文利用3輪重疊PCR將雞Ii基因的CLIP區(qū)去除,此時(shí)恰好形成了一個(gè)

6、HindⅢ酶切位點(diǎn),再通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增NDV的F343抗原表位基因,該基因片段長(zhǎng)33個(gè)氨基酸,兩段帶有HindⅢ酶切位點(diǎn)。將F343基因通過(guò)單酶切連接入Ii分子內(nèi),構(gòu)建了C1-Ii-F343內(nèi)源性靶向抗原表位嵌合體DNA疫苗。同時(shí),構(gòu)建了C1-F343非靶向DNA疫苗作為對(duì)照。30只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,用內(nèi)源性靶向DNA疫苗(C1-Ii-F343)和非靶向DNA疫苗(C1-F343)于股四頭肌進(jìn)行免疫,生理鹽